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Adjustment of analgesic protein in venom of agkistrodon halys
pallas on central endogenous opiate peptides studied by microdialysis
Ye Yong，Zhang Bingbing，Yao Guangtao，et al.
Jiangsu Yangtze River Pharmacy Group Post-doc Workstation，Taizhou225321.
【Abstract】 Objective To study the effect of analgesic C4protein in venom in agkistrodon halys pallas on central leucine-enkephalin，β-endorphin and P substance.Methods To apply microdialysis method with the probe fixed on caudate nucleus and dialysis of artificial cerebrospinal fluid，then determine neuropeptides level by HPLC monitoring their variation.Results The recovery rate of microdialysis membrane was18%～43%.The level of leucine-enkephalin in caudate nucleus increased significantly after treatment of C4protein，1.5times higher than in clonidine group，the effect lasted for8hours，but the level ofβ-endorphin and P substance changed little.Conclusion C4protein played an analgesic role in increasing level of leucine-enkephalin.
Key words venom of agkistrodon halys pallas C4protein microdialysis leu-enkephalin
微透析技术是基于活体研究的微创生物采样技术。其原理是将微透析探针插入采样组织，透析液通过微泵连续供给，连续收集，便可连续监测组织液变化 ［1］ 。我们自江浙蝮蛇毒中分离出镇痛C4组分，经过初步机制研究表明它不通过乙酰胆碱受体作用，但可能促进了内源性阿片肽的释放 ［2，3］ 。其作用的主要中枢部位为丘脑、尾状核、红核等。考虑到动物大脑结构与动物的活动特性，选择距离大脑皮层较近的部位比较利于定位实验。因此本实验采用微透析技术，定位于尾状核部位，活体观测江浙蝮蛇毒C4组分引起的疼痛神经递质的改变，探讨可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠24只，350±30g，雄性。分为4组。分组:江浙蝮蛇毒C4组分组，可乐定阳性组，阴性对照组，正常空白组。前3组均用吗啡造模，空白组不给任何药物。
1.2 药品盐酸吗啡注射液（Morphine Hydrochloride Injecˉtion），由沈阳第一制药厂生产，批号000315。生理盐水500ml，浙江平湖莎普爱思制药有限公司生产，批号:020506-2。盐酸可乐定（Clonidine Hydrochloride Tablet），由丹阳市药业有限公司生产，批号:20010730，给药剂量为2mg/kg。3%戊巴比妥钠，标准人工脑脊液ACSF，肝素，注射用抑肽酶，兰州大得利生物化学制药有限公司，批号20020519。牙 托粉及粘结剂Uibond;日本松风株式会社生产（119654）。亮氨酸脑啡肽、β内啡肽和P物质标准品由上海第二军医大学神经生物学教研室提供。
1.3 江浙蝮蛇毒C4组分 由江浙蝮蛇毒中分离纯化，纯度为92%。取20mg，加生理盐水10ml，配制成2mg/ml的溶液，尾静脉给药量0.3ml，相当于小鼠4ED50的剂量。
1.4 仪器 大鼠脑立体定位仪，浙江中医学院针灸系提供。大鼠脑立体定位图 ［4］ 。微透析探针及导管6套:BAS公司制造，透析膜长2mm，透析膜可截留分子量为20000Da。WZ单道微量注射泵:型号WZ-50C2，浙江大学医学仪器厂生产，最小流量为0.1ml/h。WATERS高效液相色谱仪。
1.5 动物造模 采用剂量递增法构建吗啡成瘾大鼠模型 ［5］ 。具体造模方法:皮下注射吗啡，每日3次（8:30，13:30，18:30），第1～4天每次剂量为5mg/kg，第5～8天每次剂量为10mg/kg，第9～11天每次剂量为15mg/kg，第12～14天每次剂量为20mg/kg，第15天8:30最后给1次10mg/kg。在吗啡给药期间，每日称量体重，并观察吗啡成瘾状态 ［6］ 。造模大鼠分为三组:阴性组、阳性组、C4组分组，以可乐定为阳性对照。每组又分为2小组，分别为一次给药组和三天给药组。
1.6 微透析方法 在吗啡撤药后24h，腹腔给予3%戊巴比妥钠0.1ml/100g相当于30mg/kg的给药量，等到大鼠呈麻醉状态时，立即将门齿和上颌部固定于立体定位器上，将耳棒插入外耳道并固定，使之稳固不动。齿门杆自中线上移3mm，耳棒插入深度约4mm。对照立体定位图，以耳间连线为基线，前移8.2mm，中线侧移3mm的坐标处为探针插入处。将此处皮毛用70%酒精擦拭后，剪开皮肤，将筋膜剪开，用牙钻在定位坐标处钻孔，穿过颅骨即止。通过立体定位器上的持臂杆固定探针底座，穿过颅骨后垂直下移3.5mm，此处即为尾状核部位。用牙托粉及粘结剂，将探针底座固定于颅骨上，3min后将探针插入底座并扣住。整个操作需在30min内完成。将探针上进口连续接微量注射泵，出口连接置于冰浴上的离心管内，开启微量注射器，以每小时0.1ml的流速灌注人工脑脊液。稳定1.5h后，开始收集透析液，离心管内预置10μl抑肽酶。每收集一管，置于沸水浴中煮5min后，于-60℃冰箱中保存。
1.7 给药方法 对于一次给药C4组分组大鼠，在灌注人工脑脊液稳定1.5h后，通过尾静脉注射江浙蝮蛇毒C4组分0.2%水溶液0.3ml，于给药后30min、60min、120min、240min、360min各收集1管，按上述方法处理保存。一次给药阳性可乐定组，则在实验动物麻醉前，一次性灌胃2ml内含0.075mg可乐定的水溶液，给药量相当于0.2mg/kg。对于3次给药组，在停吗啡后12h内给药，每日2次，至第3日，最后1次给药方法同一次给药组。
1.8 透析膜回收率的测定 取已知浓度的亮氨酸脑啡肽、β-内啡肽和P物质标准溶液30μl，将探针插入该标准液中，开启微量注射泵，采用人工脑脊液透析30min，HPLC测定未被透析部分的标准物质含量，计算透析膜回收率。
1.9 HPLC测定方法 ［7］ 色谱柱Sephasil Peptide C8，12μm ST，250mm×4.6mm;流动相A为含0.065%三氟醋酸的2%乙腈溶液，B为含0.05%三氟醋酸的乙腈;流速为1ml/min;检测器为WATERS484紫外检测器，检测波长为280nm;P-2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所研制）。进样量为5μl;数据运行时间为20min。
2 结果
2.1 吗啡造模大鼠体重变化 经过14天吗啡皮下给药后，大鼠已形成吗啡依赖症状。从体重变化中可以看出，给药前10天，体重变化不明显，有轻度增长现象，10天后体重开始下降，但不显著。结果见图1。(略)
2.2 透析膜回收率 由于透析膜对不同组分具有不同的透过率，因此需要考察本透析膜对需检测组分亮氨酸脑啡肽、β-内啡肽和P物质的回收率。已知标准液的浓度为51.2ng/ml，经30min测定后，回收率为18%～43%，基本满足透析膜回收率的要求（20%～50%）。
2.3 吗啡依赖大鼠脑组织间液神经肽的改变 大鼠形成 吗啡依赖后，尾状核、丘脑等部位亮氨酸脑啡肽的含量显著降低，但β-内啡肽和P物质的含量变化不一致。在尾状核组织透析液中也出现了类似的变化，三种神经肽中仅亮氨酸脑啡肽的含量降低，β-内啡肽和P物质的含量变化均不显著。见表1。(略)
2.4 江浙蝮蛇毒C4组分对组织间液神经肽的影响 江浙蝮蛇毒C4组分对组织中亮氨酸脑啡肽的影响十分显著，可提高它在脑组织中的含量，但对β-内啡肽和P物质的影响不显著。通过透析液的含量测定也发现，尾状核的透析液中，亮氨酸脑啡肽的含量在给药后显著增加（P<0.01），高于阴性组、阳性组，但