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病（GD）系体液免疫和细胞免疫调节异常而引发的自身免疫性甲状腺疾病（AITD）。地塞米松（Dexamethaˉsone，DEX）是一种应用广泛的激素类药物，它具有抗炎、抗过敏等作用。地塞米松也可用于甲状腺功能亢进及甲亢危象的治疗，国内亦曾有报道甲状腺注射糖皮质激素治疗Graves病 ［1，2］ ，但其确切机制尚不清楚。本文探讨了DEX对体外培养的GD甲状腺上皮细胞（TEC）Fas表达及细胞凋亡的影响以及临床指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料 胰酶（BiB分装）、1640培养液（华美生物工程公司）、胶原酶（Sigma公司）、地塞米松注射液（Sigma公司）、四甲基偶氮唑蓝（瑞士Fluka公司产品）。
1.2 方法
1.2.1 病例的选择 接受手术治疗的GD患者（女）（经家属同意）。
1.2.2 培养方法 手术切取的GD患者甲状腺组织，经1640培养液洗3次后，剪碎，用0.25%胰酶以水解细胞间的蛋白质和0.03%胶原酶以水解细胞间的胶原使细胞相互离散。用不锈筛网过滤，1500r/min离心10min，去上清，沉淀以1640培养液洗1次，悬于15%小牛血清1640培养液中，取少量细胞悬液，加等量台盼蓝液（染色剂）混合2min后，在显微镜下记数，证实活细胞数大于95%。
1.2.3 细胞增殖抑制试验 调细胞浓度为2×10 6 /ml左右，加入96孔培养板中，每孔200μl，置37℃5%二氧化碳孵箱中培养24h换液，并按设计浓度加入地塞米松注射液（DEX）作用不同的时间，分别为4h、8h、12h、24h、48h、72h，于培养结束前4h加入1mg/ml的四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液，以二甲亚砜溶解形成的甲 月赞 颗粒，酶标仪（上海三科仪器 有限公司）上测定A 570nm 值，此值反应细胞增殖程度，与活细胞数成正比。
1.2.4 细胞凋亡及凋亡蛋白相关检测 细胞浓度同上，加入12孔培养板（孔内置消毒盖玻片），每孔1ml，24h后换含10 -5 mol/L DEX的培养液，继续培养，于0、6、12、24、48、72h取出盖玻片，分别检测凋亡细胞及Fas蛋白表达。凋亡细胞检测采用DNA片段原位末端标记（Tunel）法 ［3］ ，以5%多聚甲醛固定20min，PBC液洗2次，0.1%TritonX-100（表面活性剂）4℃浸泡2min，经PBS洗涤2次后，加Tunel反应液、37℃湿盒孵育30min，PBS洗2次，加碱性磷酸酶抗体，37℃湿盒内30min，PBS洗2次，加入底物溶液，核固红复染，水性封片剂封片，高倍镜下观察。细胞核蓝黑色为阳性，随机选取10个视野，计算阳性细胞构成比。Fas蛋白检测采用S-P法 ［4］ ，丙酮固定，按试剂盒说明染色，DAB显色，苏木素复染，常规封片后光镜下观察，阳性信号为金黄色，计算阳性细胞构成比。试剂购自福建迈新公司。
1.2.5 细胞形态学观察 收集12孔培养孔内剩余细胞涂片，丙酮固定，HE染色，光学显微镜下观察细胞形态。
1.2.6 统计学处理 采用SPSS8.0软件进行相关分析。
2 结果
2.1 形态学 DEX干预12h即可见细胞大小不一，形态不规则，24h后部分细胞胞浆内出现空泡，有的胞浆极少，呈裸核样细胞，并可见许多细胞碎片。
2.2 DEX浓度及作用时间对TEC的影响 DEX对TEC具有明显的增殖抑制作用，其浓度在10 -6 ～10 -2 mol/L之间，作用时间与A 570nm 值呈明显负相关，即随着浓度增高，细胞数逐渐减少（见表1）。
表1 地塞米松浓度及作用时间对GD甲状腺细胞的影响
2.3 DEX对TEC凋亡及Fas表达的影响 10 -5 mol/L浓度 DEX作用TEC6h出现Fas表达的增加，12h即可诱导TEC凋亡，两者均具有时间依赖性，呈明显正相关（r=0.96，P<0.05）。见图1。图1地塞米松对GD甲状腺细胞Fas蛋白表达及凋亡的影响
3 讨论
Graves病系指器官特异性自身免疫性疾病，以高代谢症候群、甲状腺肿大、突眼等表现为主要临床特征，其发病与肌体免疫功能紊乱相关，近年来我国实行全民性食盐加碘，Graves病的发病率有增加趋势，如何控制与治疗Graves病亦显得尤为重要。地塞米松为糖皮质激素类药物，它的作用是抗炎、抗过敏、抗毒素、抗休克、调节代谢、调节淋巴细胞和其它血液细胞及提高中枢神经系统的兴奋性。临床应用极为广泛，可用于严重感染、传染病、胶原病、过敏性疾病、各种休克、造血系统疾病及甲亢危象。在治疗甲状腺功能亢进及甲亢危象中，确切机制尚不清楚。通过上述实验可以证实DEX对TEC凋亡及Fas表达有一定的影响。细胞凋亡（apoptosis）是一种由特定基因控制的细胞程序性死亡，是不同于细胞坏死的生理性死亡过程，在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟等多种生理病理过程中起着重要的作用 ［5］ 。正常的细胞凋亡是生命活动的组成部分，细胞凋亡过早、过多、过迟或过少均可导致疾病的发生与发展。细胞凋亡在分子水平上受多种基因的调控，其中，Fas/FasL尤其引人瞩目。Fas是细胞表面诱导凋亡的分子，表达于激活的淋巴细胞、病毒感染细胞、肿瘤细胞及一些组织等。Fas的主要作用是传递凋亡信号介导细胞凋亡。而FasL是Fas的天然配体。细胞通过其表面的FasL与另一细胞上的Fas结合使另一细胞死亡，这就是Fas介导的凋亡。在生理情况下，Fas/FasL系统介导的凋亡在机体免疫系统中发挥着重要作用:（1）下调免疫反应及参与外周免疫耐受的维持;（2）作为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）杀伤靶细胞的效应机制;（3）维持机体某些部位的免疫豁达。一旦Fas/FasL系统发生失衡将导致机体多种疾病的发生及发展。1997年Hammound等证实Graves病患者甲状腺也存在细胞凋亡现象 ［6］ 。有文献报道GD甲状腺细胞存在 Fas异常表达，可抑制GDTEC Fas介导的细胞凋亡的发生，这可能与GDTEC的增殖有关 ［7］ 。Fas表达异常，可加重甲状腺肿大及局部内环境紊乱，并在GD的发病机制中发挥着重要作用。上述实验结果表明，DEX可时间依赖性地促进TEC Fas表达并诱导TEC凋亡。
局部注射DEX治疗GD，可有效控制GD的临床症状，并使患者肿大的甲状腺明显缩小。一般认为前者与抑制TSH的生成，抑制周围组织的T 4 脱碘生成T 3 ，增加甲状腺素结合前蛋白的浓度以降低游离甲状腺的释放有关，后者的机制尚不清楚。本文研究表明DEX对TEC具有直接的杀伤作用。DEX对TEC的增殖抑制作用具有明显的浓度依赖关系，其浓度在10 -6 ～10 -4mol/L时，随着浓度增高死亡细胞逐渐增多;当DEX浓度超过10 -4 mol/L时，基本无存活细胞;而当DEX浓度低于10 -6 mol/L时，实验孔与对照孔几乎无差异，由此提示，临床在应用DEX局部注射治疗GD时应选择合适的剂量。一般认为DEX可诱导淋巴细胞和单核巨噬细胞的凋亡 ［8］ ，本文的结果表明DEX亦具有诱导TEC凋亡的作用，其最适浓度在10 -5 mol/L左右，呈明显时间依赖性，这可能亦为DEX局部注射治疗GD及用于甲亢危象救治的重要机制之一。Fas基因是重要的死亡基因，其表达产物Fas抗原与FasL结合后可介导多种组织细胞的凋亡 ［9］ ，本文DEX作用TEC6h即可见Fas蛋白表达的增加，且Fas阳性细胞构成比与凋亡细胞构成比呈正相关，由此推测，Fas系统可能是DEX诱导GD甲状腺细胞凋亡的重要途径。
参考文献
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9 Nagata S，Golstein P.The Fas death factor.Science，1995，267:1449-1456.
作者单位:161000黑龙江省齐齐哈尔市第一医院