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Wen Yanting，Ou Yangjian，Chen Junhao
Hemology Department，Gulou Hospital，Nanjing210008.
【Abstract】 Objective To study the changes of interleukin-2（IL-2），interleukin-4（IL-4），interleukin-10（IL-10），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and gamma interferon（IFN-γ），which secreted by the T lymˉphocytes in patients with chronic ITP who had been treated by prednisone and had positive effects.And to determine the relationship between the changes of these cytokines and the positive effects of prednisone.Methods 8patients with chronic ITP who had been treate
d by prednisone and10people who came for physical examination were studied.The peripheral blood mononuclear cell（PBMC）was separated，which was then activated by PHA.The PBMC was inˉcubated for6hours.The levels of the cytokines secreted by the PBMC were measured using flow metry.Results Compared to normal controls，these patients with chronic ITP showed a decrease in IL-2，IL-4，IFN-γand TNF-α，while the level of IL-10showed no statistical changes.Conclusion These chan
ges may correlate to the positive effects of predinisone.
Key words idiopathic thrombocytopenic purpura cellular immunity peripheral blood mononuclear cell cyˉtokines IL-2 IL-4 IL-10 TNF-α IFN-γ
特发性血小板减性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一种血液循环中血小板数减少，伴有皮肤、粘膜出血，重者内脏亦有出血的临床常见出血性疾病。近年来的研究表明，某些细胞因子与ITP的发病及临床进展有关 ［1，2］ 。一些研究显示了ITP患者细胞免疫的缺陷:包括体内和体外细胞因子表达的变化，及一些不同的淋巴细胞功能的缺陷 ［3］ 。本实验中，我们以流式细胞仪检测经强的松治疗的慢性ITP患者外周血单核细胞（PBMC）经PHA激活后分泌的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平，以探讨慢性型ITP患者细胞免疫功能变化及这些指标在该病中的意义。
1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 病例组
经强的松治疗的有效的慢性ITP患者（以下简称ITP组）8例，其中男2例，女6例，年龄13～66岁，均为南京市鼓楼医院2002年12月～2003年1月间门诊就诊的患者，符合首届中华血液学会全国血栓与止血学术会议有关出凝血疾病的诊断标准 ［4］ 及疗效标准 ［5］ 。采标本时患者服药情况及血小板计数情况如表1。
表1略
1.1.2 对照组
10例，男6例，女4例，年龄23～48岁。均为南京市鼓楼医院2002年12月～2003年1月间体检正常者。
1.2 试剂和方法
1.2.1 主要试剂
细胞内细胞因子抗体:IL-2-PE、IL-4-PE、IL-10-PE、TNF-α-PE和IFN-γ-PE（美国CALTˉAG公司产品）。
1.2.2 主要仪器
BDFACScalibur流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司产品）。
1.2.3 方法
取空腹静脉血2ml，肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。用含体积分数为10%的小牛血清的RPˉ MI-1640洗涤，再用RPMI-1640培养液调整细胞数至2× 10 6 /ml。用促细胞分裂剂PHA激活单核细胞，在37℃、体积分数为5%的CO 2 孵箱中温育6h。取上清，加入吸引珠（Capture Beads）和细胞内细胞因子抗体，常温避光孵育3h，用流式细胞仪测定IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。
1.2.4 统计学分析
两样本均数比较，方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t′检验。
2 结果
ITP组和对照组PBMC经PHA刺激后分泌的IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α均较对照组为低。而IL-10水平差异无统计学意义。各项指标检测结果见表2。
表2 略
3 讨论
近年来实验证明，ITP患者淋巴细胞活化和Th1/Th2介导的细胞因子生成均有异常，其活化T细胞增多 ［6］ 。Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和TNF-β;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。Th1和Th2细胞通过分泌细胞因子，彼此进行交叉调节、相互抑制，故在免疫应答的启动阶段，如果机体免疫系统选择了某一亚群为主的应答，这种Th细胞就会正反馈地加强自身优势，压抑另一亚群发展。一般来说，自身免疫性疾病由Th1细胞介导，在与发病相关的细胞因子中，Th1型细胞因子往往促进病情发展，Th2型则抑制病情发展。Andersson报道ITP与Th1型细胞因子应答有关，而Th2型细胞被下调 ［7］ 。这说明ITP也是由Th1细胞介导的。按本实验所得结果，经强的松治疗的ITP患者Th1细胞分泌的细胞因子被下调，Th2型细胞因子也有被下调的趋势。
Yhhoshimura等报道慢性ITP患者T细胞分泌的IL-2水平增高 ［8］ 。本实验显示，经强的松治疗后，ITP组的IL-2较对照组为低。IL-2是T细胞生长因子，既诱导细胞产生IFN-γ，也激活B细胞和巨噬细胞。IL-2和IL-2受体相互作用，刺激T细胞增殖。Garcia-Suarez等报道慢性ITP患者IFN-γ和TNF-α水平增高 ［9］ 。本实验结果为IFN-γ和TNF-α均较对照组为低。IFN-γ是处于有丝分裂状态下的T细胞受刺激产生的，可能依赖于先前产生的IL-2。本实验结果中IL-2和IFN-γ出现的同时下降趋势也符合该理论。有证据表明IFN-γ处理抗原递呈细胞，促进T细胞功能。ITP组的IL-2和IFN-γ水平的下降，在一定范围内说明了这些患者的
治疗取得了一定效果。
Webber等报道慢性ITP患者IL-4水平增高 ［10］ ，而Alan等报道其IL-4水平降低 ［11］ 。本实验ITP组IL-4较对照组为低。IL-4增高是病理性B细胞分化和生存的条件之一，它能使B细胞激活，增生并产生IgG，促进体液免疫。ITP组的IL-4水平下降，可能是经治疗后ITP患者体 内的病理性B细胞水平降低的机制之一。Imbach P等报道 慢性ITP患者IL-10水平增高 ［12］ 。本实验ITP组IL-10水平与正常对照组比较无统计学意义。IL-10通过抑制APC与IFN-γ的作用间接促进Th2细胞而抑制Th1细胞增殖，同时发挥促进IL-4产生的作用，进而抑制Th2细胞，间接促进Th1细胞增殖。因此IL-10是一种双抑制的反馈因子，对Th1细胞和Th2细胞增殖有双向调节作用，可防止机体细胞因子过度形成而致的不良后果，并有抗炎作用 ［13］。ITP组患者IL-10水平与正常对照无差异可能与治疗有关。
糖皮质激素有强烈的抗炎作用。它通过与糖皮质激素受体结合即nGRE的相互作用而抑制了一些慢性炎症有关的细胞因子如IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α等的转录。而这些细胞因子水平的下降又通过细胞因子网络下调其他细胞因子水平。ITP组的患者均经过了一定时间的激素治疗，血小板计数6例达到正常，2例增高，临床症状得到明显改善。故关于病例组细胞因子水平所出现的下降趋势，可能是由于激素强的松对该病的治疗效果所致。
在既往研究中，大部分学者是采用ELISA法来测定细胞因子水平的。而ELISA法的精确性受许多主观因素的干扰。本实验使用了流式细胞仪细胞内因子检测法，比起既往方法，更为快速方便和准确。
本实验结果提示与正常对照相比，经强的松治疗的慢性ITP患者IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平降低，有统计学意义，IL-10水平与正常对照没有统计学意义。这些细胞因子水平的变化可能与强的松的治疗效果有关。采用流式细胞仪检测细胞内细胞因子快速、方便、准确。
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作者单位:210008南京大学医学院附属鼓楼医院