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Effects and its mechanism of ganoderma lucidum on the treatment of minimal residual leukemia in mice
Chen Honghong，Cheng Wenying，Shi Jianhui，et al.
Institute of Radiation Medicine，Fudan University，Shanghai200032
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ganoderma lucidum on the treatment of minimal residual leukemia in mice and explore its mechanism.Methods Ganoderma lucidum were administered orally to MRL model mice daily at the dose of0.4g/kg for twelve and twenty-two consecutive days，respectively.The survival time in MRL mice and pathological changes of spleen and bone marrow immersed by leukemic cell were observed.The apoptosis and cell cycle of leukemic cell were determined with flow cytometry.TNF-αactivity was measured by ELISA method.colony-forming tests were performed in bone marrow cells.The white blood cells，lymphocyte counts and T-lymphoˉcyte subsets in the peripheral blood were assayed.Results Ganoderma Iucidum could obviously prolong the survival time of MRL mice（P<0.001）.When it was administered to MRL mice for twelve days，ganoderma lucidum could markedly induce the apoptosis of leukemic cells，inhibit their synthesis of DNA and reduce their immersion in the spleen.TNF-αactivity in the peripheral blood was enhanced.The number of white blood cells and lymphocytes in the peripheral blood and CFU-G in bone marrow significantly increased compared with MRL control group on the third or senventh day after Ganoderma lucidum was giver to MRL mice.The disorder of T-lymphocyte subsets was regulated.The number and volume of white medulla in the spleen increased，indicating enhancement of immune response in vivo.Conclusion Ganoderma lucidum could postpone the reoccurrence of minimal residual leukemia by inducing leukemic cells apoptosis，promoting the restoration of hematopoiesis and enhancing immune function.Its mechamism was closely related to the enhancement of TNF-αactivity and immune fumction.
Key words ganoderma lucidum minimal residual leukemia apoptosis TNF-α CFU-G mice
微小残留白血病（minimal residual leukemia，MRL）是指白血病诱导化疗（或骨髓移植治疗）获完全缓解后体内残留少量白血病细胞的状态。一般临床化疗诱导缓解时，患者体内尚留存白血病细胞可能在10 0 ～10 10 之间，由于这部分细胞本身产生抗药性以致化疗失效，是白血病复发的根源，因此寻找治疗残留白血病的药物仍是白血病研究领域中极为重要的课题。灵芝是一种真菌类的名贵中药，具有多方面的生理活性与药理作用。近年来研究证实，灵芝能有效抑制人白血病细胞株的体外生长 ［1～3］ ，但是否对微小残留白血病有效尚未见到报道。本研究采用微小残留白血病小鼠模型，观察灵芝的疗效，并从细胞凋亡和免疫学角度探讨其疗效机制，为灵芝作为辅助药物应用于临床提供依据。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 灵芝由日本和汉生药研究所提供，为深棕色粉末，加生理盐水、置80℃水浴中振荡4h溶解稀释成一定浓度。大鼠抗小鼠单克隆抗体（anti-CD3-TC、anti-CD4-PE、anti-CD8-FITC）购自美国CALTAG LABORATOˉRIES公司;TNF-α检测试剂盒购于上海晶美生物工程有限公司。
1.2 小鼠急性淋巴细胞白血病P388细胞株 购自中国科学院上海细胞所。
1.3 动物 DBA小鼠，♀，体重19～20g，购自中国科学院上海实验动物中心。
1.4 实验方法
1.4.1 微小残留白血病（MRL）模型制备 按我室自行建立的小鼠模型 ［4］ 。取对数生长期的P388白血病细胞，配成6×10 6 个/ml细胞悬液，接种于DBA小鼠，腹腔注射0.2ml/只（每只DBA小鼠接种1.2×10 6 细胞）。于接种后第3天一次腹腔注射环磷酰胺（Cy）70mg/kg，建成P388/DBA小鼠微小残留白血病模型。
1.4.2 灵芝对微小残留白血病（MRL）小鼠生存期的影响 微小残留白血病模型小鼠30只，随机分为2组，即模型组和灵芝用药组，每组各15只。用药组灌胃灵芝0.4g/kg（相当于人体推荐用量的6倍），每天1次，给药至小鼠死亡为止。模型组灌胃生理盐水。全程进行生存期观察。
1.4.3 灵芝诱导残留白血病细胞凋亡和对造血、免疫功能的影响 将34只DBA小鼠随机分为3组:①正常对照组10只;②MRL模型组10只;③灵芝给药组14只:灵芝所用剂量为0.4g/kg。造模后开始灌胃灵芝0.2ml/20g鼠，每天1次，连续12天;正常对照组和MRL模型组同时灌胃生理盐水。用药后第13天，将小鼠麻醉后颈动脉放血，取股骨、脾进行相关指标检测。
1.5 观察指标和检测方法 （1）生存期:观察小鼠存活情况，每24h记录1次。（2）细胞凋亡和细胞周期检测:取白血 病细胞浸润的小鼠脾脏制成单细胞悬液，PBS洗涤2次，经RNase处理，PI染色，上流式细胞仪（美国B.D.公司FACˉSCalibur）分析，数据采用B.D.公司的ELLQUEST、ModFITLT for mac V1.01软件进行处理。（3）TNF-α活性测定:按照上海晶美生物工程有限公司TNF-α检测试剂盒中的操作步骤，采用ELISA方法测定小鼠血清中TNF-α含量。（4）脾、骨髓病理切片:样品采用10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚4μm，HE染色，OlympusBX50镜检，摄影。（5）外周血白细胞及淋巴细胞计数、细胞亚群测定:分别于灵芝给药后第3、7、13天，眼眶取血，计数外周血白细胞和淋巴细胞数。于给药后第13天，取肝素抗凝血100μl，分别加入抗CD 3 、CD 4 和CD 8 荧光标记的单克隆抗体进行孵育，经溶血素处理、PBS洗涤后上流式细胞仪（美国B.D.公司FACSCalibur）测定小鼠T淋巴细胞亚群（CD +3 、CD +4 和CD +8 ）。（6）骨髓细胞粒系集落形成单位培养:于给药后第8天，分别取正常对照组、MRL模型组和灵芝用药组小鼠股骨骨髓细胞，每组各4只，采用半固体琼脂法培养。RMPI-1640培养体系中各成分的终浓度为:胎牛血清25%，琼脂0.3%，骨髓细胞2×10 5 个/ml，rhG-CSF1μg/L，培养体系终体积为4ml。5%CO 2 饱和湿度，37℃培养7天，低倍镜下计数，40个以上细胞为一集落。
2 结果
2.1 灵芝对微小残留白血病（MRL）小鼠生存期的影响 从表1可见，口服0.4g/kg灵芝能明显延长MRL小鼠存活期（P<0.001），延长率为26%。
表1 灵芝对微小残留白血病（MRL）小鼠存活期的影响 注:与MRL模型组相比， ˇˇˇ P<0.001
2.2 灵芝对MRL小鼠脾脏、骨髓白血病细胞浸润的影响 MRL小鼠化疗后第13天，脾脏红髓轻度增生，每个低倍镜视野（10×20×）均可见白血病细胞浸润灶，占窦内面积的1/3左右（+++）（图1A）;白髓数（15±3）个/10个低倍镜视野（10×20×）。口服灵芝12天后，脾脏红髓内幼稚淋巴细胞浸润减少，占窦内面积10%或20%以下（+～++）（图1B）;白髓数为（18±4）个/10个低倍镜视野，比MRL模型组明显增加，且白髓的体积也增大。
MRL模型组股骨骨髓病理切片观察发现，4只小鼠只有1只鼠可见骨髓淋巴系和幼稚粒系相对增加，成熟粒系明显减少，提示骨髓有白血病细胞浸润的可能。灵芝用药组未见幼稚淋巴细胞增加。
2.3 灵芝对MRL小鼠脾脏白血病细胞凋亡和细胞周期的 影响 MRL小鼠白血病细胞浸润脏器以脾脏为主，将脾脏制成单细胞悬液，用流式细胞仪进行检测（见图2），口服灵芝12天的MRL小鼠脾脏细胞DNA直方图上除可见正常细胞的G 1 、G 2 峰外，还显示较强的凋亡细胞特征性的亚二倍体（亚G 1 ）峰，比MRL模型组的亚G 1 峰明显增加，表明灵芝能诱导浸润脾脏的白血病细胞凋亡。如表2所示，灵芝用药组小鼠脾脏白血病细胞凋亡率明显高于模型组（P<0.01）。从细胞周期变化看，模型组S期细胞比例较正常对照组明显升高（P<0.01），G 0 /G 1 和G 2 /M期细胞比例有下降趋势。给予灵芝12天后，S期细胞比例下降，显著低于MRL模型组（P<0.05），G 0 /G 1 和G 2 /M期细胞比例与正常对照无差别。
表2 灵芝对MRL小鼠脾脏浸润白血病细胞凋亡和细胞周期的影响 （略）注:与MRL模型组相比， ˇˇ P<0.01
2.4 灵芝对MRL小鼠血清TNF-α活性的影响 MRL模型组化疗后第13天，外周血TNF-α的水平为（20.2±5.3）pg/ml，口服灵芝12天后，TNF-α的水平显著升高为（36.7±6.5）pg/ml（P<0.05），较MRL模型组增加约80%。
2.5 灵芝对MRL小鼠外周血白细胞、淋巴细胞及骨髓粒 系集落形成单位形成的影响 由表3可见，MRL小鼠化疗后第3天，白细胞及淋巴细胞数降低至正常对照的20%左右，化疗后第7天已逐渐回升。灵芝可使MRL小鼠化疗后第3、7天WBC数、淋巴细胞数显著高于模型组（P<0.01）。
表3 灵芝对MRL小鼠外周血白细胞及淋巴细胞的影响 （略）注:与MRL模型组相比， ˇˇ P<0.01
从图3可以看出，MRL小鼠化疗后第8天，骨髓CFU-G形成明显受到抑制，较正常对照下降了7倍。连续7天口服灵芝0.4g/kg，MRL小鼠骨髓CFU-G集落数显著增加为MRL模型组的2倍（P<0.05）。
2.6 灵芝对MRL小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 正 常对照组、MRL模型组和灵芝用药组均分别取8只小鼠进行 检测，经计算机软件处理得荧光标记细胞（3种T淋巴细胞亚群）占总的淋巴细胞的百分率。由表4可见，MRL模型组化疗后第13天，CD +3 、CD +4 /CD +8 比例较正常对照相比明显下降，表明机体的免疫功能显著降低。口服灵芝12天后，CD +3 基本回升，与MRL模型组比较，差异有显著性（P<0.05），CD +4 /CD +8 比例亦有所恢复。
表4 灵芝对MRL小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响组别 注:与模型组相比， ˇ P<0.05
3 讨论
目前，对微小残留白血病的治疗是采用化疗（甚至是大剂量）杀灭白血病细胞，但无法将白血病细胞全部杀死。同时，化疗将造成骨髓抑制的副作用，以致于患者造血功能低下、免疫功能受损。此外，白血病发生的原因之一是免疫监视功能低下，化疗加重了免疫功能的损伤，对免疫系统的抑制也阻碍了机体的恢复。目前临床治疗尚无其他特效的方法。
灵芝多糖和灵芝酸等是灵芝的主要有效成分。有研究报道 ［2］ ，灵芝多糖通过增强小鼠巨噬细胞功能体外诱导人白血病HL-60细胞凋亡，但在体外并不能直接抑制HL-60细胞的增殖和诱导凋亡。我们的体外实验也证实 ［1］ ，灵芝与小鼠腹腔巨噬细胞共培养上清液能有效抑制P388增殖，诱导细胞凋亡。检测共培养上清液中肿瘤坏死因子（TNF-α）活性发现有明显升高，可能是促进白血病细胞凋亡的机制之一 ［5］ 。本研究采用小鼠微小残留白血病模型，从整体水平观察灵芝的治疗效果及其作用机制。结果表明，灵芝可通过诱导微小残留白血病小鼠白血病细胞凋亡，减缓其白血病复发的速度，延长其生存期。流式细胞仪检测发现，灵芝能诱导浸润脾脏的白血病细胞凋亡率明显增高，且对细胞周期也有一定的影响，使S期的白血病细胞数较MRL模型组显著减少，提示灵芝主要作用于DNA合成期，抑制白血病细胞的生长代谢，并使之迅速凋亡。灵芝能使MRL小鼠外周血TNF-α活性升高、诱导残留白血病细胞凋亡，进一步证实了体外实验结果。脾脏病理观察进一步显示，灵芝使MRL小鼠脾脏红髓内白血病细胞浸润明显减少，两者结果完全吻合。 研究已证实，灵芝能提高正常或受损机体的免疫防御和免疫监视功能 ［6，7］ ，本研究表明，灵芝还能使MRL小鼠外周血白细胞数提高，骨髓粒系祖细胞集落形成增加，对化疗后造血功能的恢复有一定的促进作用。同时，MRL小鼠灌胃灵芝后外周血CD +3 （总T）细胞升高，CD +4 /CD +8 比例趋于正常，紊乱的T细胞亚群得以调整恢复，提示灵芝有的免疫增强和免疫调节作用，通过恢复自身的免疫功能，提高机体杀伤白血病细胞的能力，通过脾脏的病理观察也得以证实，灵芝可使MRL小鼠脾脏白髓数增加，体积增大，反映机体免疫应答反应增强。
以上研究结果表明，灵芝能延长MRL小鼠的生存期，诱导小鼠体内残留白血病细胞的凋亡，延缓白血病的复发，同时又能减轻化疗引起骨髓抑制的副作用，促进造血，增强免疫功能，这就是灵芝辅助治疗白血病的优势所在。（本文图片见封三）
参考文献
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作者单位:1200032上海复旦大学放射医学研究所
美国纽约中西医结合诊疗中心
日本和汉生药研究所