不同配比头孢他啶/三唑巴坦钠的体外抗菌活性研究

　　【摘要】 目的  评价不同配比头孢他啶/三唑巴坦（CAZ/TAZ）的体外抗菌活性。 方法  采用琼脂平皿二倍稀释法测定不同配比CAZ/TAZ对812株临床分离致病菌的MIC。 结果  不同配比CAZ/TAZ（1:1、2:1、4:1、8:1）对812株临床分离菌均有广谱抗菌作用，CAZ/TAZ1:1、2:1、4:1的抗菌活性相近，稍强于CAZ/TAZ8:1。不同配比CAZ/TAZ对产β-内酰胺酶的金葡菌、表葡菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、醋酸钙不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌，以及产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷白杆菌、醋酸钙不动杆菌的抗菌活性比CAZ强2～8倍，但对产酶的铜绿假单胞菌的抗菌活性与CAZ相近。CAZ/TAZ对不产β-内酰胺酶的金葡菌、表葡菌、铜绿假单胞菌、化脓链球菌、肺炎链球菌的抗菌活性与CAZ相近。CAZ/TAZ对MRSA、MRSE、粪肠球菌的抗菌活性差。 结论  不同配比CAZ/TAZ均有较强的体外抗菌活性，CAZ/TAZ1:1、2:1、4:1的抗菌活性相近，稍优于CAZ/TAZ8:1，TAZ增强了CAZ抗产β-内酰胺酶细菌的活性。
       
     
　　In vitro antibacterial activities of ceftazidime/tazobactam
     
　　Zhao Longyin，You Xuefu，Lou Renhui，et al.
   
　　Institute of Medicinal Biotechnology，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100050.
   
　　【Abstract】 Objective To evaluate the in vitro antibacterial activities of ceftazidime/tazobactam（CAZ/TAZ）1:1，2:1，4:1and8:1.Methods The minimal inhibitory concentrations（MICs）of CAZ/TAZ against812clinical isolates of bacteria were tested by standard agar dilution method.Results CAZ/TAZ1:1，2:1，4:1and8:1had broad antibacterial activities against812clinical isolates，and the activities of CAZ/TAZ1:1、2:1and4:1were simi-lar but a little stronger than those of CAZ/TAZ8:1.The antibacterial activities of CAZ/TAZ1:1，2:1，4:1and8:1againstβ-lactamase-producing S.aureus，S.epidermidis，E.coli，K.pneumoniae，A.calcoacetius，E.cloa-cae，E.aerogenes，S.marcescens，and ESBLs-producing E.coli，K.pneumoniae，A.calcoacetius were2～8stronger than those of CAZ.Its antibacterial activity againstβ-lactamase-producing Ps.aeruginosa was similar to that of CAZ.The antibacterial activities of CAZ/TAZ1:1，2:1，4:1and8:1against non-β-lactamase-producing S.aureus，S.epidermilis，Ps.aeruginosa，S.pyogenes and S.pneumoniae were similar to those of CAZ.CAZ/TAZ1:1，2:1，4:1and8:1showed low antibacterial activities against MRSA，MRSE and E.faecalis.Conclusion Ceftazidime/tazobactam1:1，2:1，4:1and8:1had relatively high in vitro antibacterial activities，and tazobactam en-hanced the antibacterial activity of ceftazidime againstβ-lactamase-producing strains.The activities of CAZ/TAZ1:1、2:1and4:1were similar but a little stronger than those of CAZ/TAZ8:1.
     
　　【Key words】 ceftazidime/tazobactam ceftazidime tazobactam MIC
      
　　三唑巴坦（他唑巴坦，Tazobactam，TAZ）为新型β-内酰胺酶抑制剂，在舒巴坦（Sulbactam，SBT）基础上增加了一个三氮唑环，是舒巴坦的衍生物，具有广谱抑酶活性，对各种细菌产生的酶均有很强的抑制作用 ［1］ ，这与三唑巴坦可形成稳定的瞬时中间产物（transient intermediate）有关 ［2］ 。头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）为第三代头孢菌素，抗菌谱广，抗菌作用强，对金葡菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌等均有较强抗菌作用，并且头孢他啶是头孢类中唯一一个对假单孢类细菌有活性的抗生素 ［3］ 。为评价不同配比CAZ/TAZ和CAZ的抗菌活性，我们进行了体外抗菌活性研究。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 药物及其配制 头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）批号030113，含量88.4%，珠海区丽珠合成制药有限公司产品;三唑巴钠（他唑巴坦钠，Tazobactam，TAZ）批号03020016，含量92.4%，山东齐鲁制药有限公司产品;头孢哌酮（Cefoper-azone，CPZ）批号31810610，含量93.5%，珠海联邦制药有限公司产品;舒巴坦钠（Sulbactam，SBT）批号31330103，含量91.6%，珠海联邦制药有限公司产品;均由哈尔滨星火药物研究院提供。哌拉西林（Piperacillin，PIPC）批号0419—9502，含量91.3%，头孢噻肟（Cefotaxime，CTX）批号130483-200102，含量90.6%，头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）批号0484-9901，含量84.9%，克拉维酸（Clavulanic acid，CVA）批号429-9301，含量92.0%，苯唑西林（Oxacillin）批号0482-9901，含量90.4%，均为中国药品生物制品检定所标准品。药物配制时按实际活性药物计算。Nitrocefin纸片为美国DIFCO公司产品。
   
　　1.2 培养基和试剂 MH肉汤（Mueller-Hinton Broth）培养基、脑心浸液（Brain Heart Infusion）培养基均为美国DIFCO公司产品;MH琼脂培养基、营养肉汤和小牛血清由中国药品生物制品检定所购进。
   
　　1.3 细菌 试验菌株为实验室保存典型菌种及2002～2003年从北京地区医院收集的12种812株临床分离菌，革兰阳性菌有:金葡菌148株（MSSA66株、MRSA82株、产β-内酰胺酶金葡菌141株、不产β-内酰胺酶金葡菌7株）、表葡菌110株（MSSE15株、MRSE92株、产β-内酰胺酶表葡菌69株、不产β-内酰胺酶表葡菌38株）、化脓链球菌37株（不产酶）、肺炎链球菌37株（不产酶）和粪肠球菌37株（不产酶）;革兰阴性菌有:大肠埃希菌111株（均产酶，产ESBLs大肠埃希菌17株、不产ESBLs大肠埃希菌94株）、肺炎克雷伯杆菌110株（均产酶，产ESBLs肺炎克雷伯杆菌39株、不产ESBLs肺炎克雷伯杆菌71株）、醋酸钙不动杆菌74株（均产酶，产ESBLs醋酸钙不动杆菌10株、不产ESBLs醋酸钙不动杆菌64株）、铜绿假单胞菌74株（产β-内酰胺酶铜绿假单胞菌65株、不产β-内酰胺酶铜绿假单胞菌9株）、阴沟肠杆菌19株（均产酶）、产气肠杆菌18株（均产酶）和粘质沙雷氏菌37株（均产酶）。合计产β-内酰胺酶细菌644株。
   
　　选用金葡菌ATCC29213、肺炎链球菌ATCC49619、粪肠球菌ATCC29212、大肠埃希菌ATCC25922、ATCC35218、铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌，质控菌MIC均在NCCLS规定范围内 ［4，5］ 。
   
　　细菌β-内酰胺酶（β-lactamase）用Nitrocefin纸片测定，大肠埃希菌和肺炎克雷白杆菌超广谱酶（Extend-spec-trumβ-lactamases，ESBLs）用头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸和头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸测定，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、耐甲氧西林表葡菌（MRSE）用苯唑青霉素（Oxacillin）测定，具体方法均按照NCCLS规定要求进行 ［4，5］ 。醋酸钙不动杆菌ESBLs测定参照大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌方法进行。
   
　　1.4 仪器 多点接种器（Multipoint inoculator A400）为英国DENLEY公司产品;自动分装器（Automatic dispensor）为美国OXFORD公司产品;二氧化碳培养箱为美国FORMA公司产品;超低温（-80℃）冰箱为日本SANYO公司产品。广州仪科实验室技术公司IKA（r）MS2型液体涡漩混合器。
   
　　1.5 最低抑菌浓度（MIC）测定 参照NCCLS2003标准 ［4，5］ ，采用平皿琼脂二倍稀释法和Denlay多点接种器（Multipoint Inoculator A400）进行药敏实验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌;药物用MH肉汤二倍稀释成各种所需浓度，分别加适量到平皿中，MH琼脂培养基溶化后定量注入含药液平皿内混匀，药物的终浓度分别为0.03……128mg/L，肺炎链球菌、化脓链球菌和粪肠球菌的培养基内含5%脱纤维的羊血，接种试验菌（接种量约为10 4 CFU/点）后置35℃恒温培养18h（肺炎链球菌培养24h、化脓链球菌置5%CO 2 培养箱培养24h）后观察结果，无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。 

　　2 结果
    
　　不同配比CAZ/TAZ（1:1、2:1、4:1、8:1）对812株临床分离致病菌的MIC测定结果见表1。结果表明，不同配比CAZ/TAZ对812株临床分离菌均有广谱抗菌作用，CAZ/TAZ1:1、2:1、4:1的抗菌活性相近，稍强于CAZ/TAZ8:1。
   
　　CAZ/TAZ1:1、2:1、4:1对141株产酶金葡菌、69株产酶表葡菌的MIC 50 值分别为16、64mg/L，抗菌活性比CAZ分别强8倍、>2倍，稍优于CAZ/TAZ8:1，与PIPC/TAZ和CPZ/SBT相近。不同配比CAZ/TAZ对7株不产酶金葡菌、38株不产酶表葡菌、66株甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）、15株甲氧西林敏感表葡菌（MSSE）、82株耐甲氧西林金葡菌（MR-SA）、92株耐甲氧西林表葡菌（MRSE）抗菌活性与CAZ相近，MIC 50 值均分别为8、16、8、8、>64、64mg/L。不同配比CAZ/TAZ对不产酶的化脓链球菌37株、肺炎链球菌37株具有较强抗菌作用，MIC 50 值均为0.25mg/L，抗菌活性与CAZ、PIPC/TAZ和CPZ/SBT基本相同，对37株粪肠球菌的抗菌活性弱，MIC 50 值均在128mg/L以上。
   
　　不同配比CAZ/TAZ对全部产酶的111株大肠埃希菌、110株肺炎克雷伯杆菌的MIC 50 值均为0.25mg/L，对74株醋酸钙不动杆菌的MIC 50 值为2mg/L，均比CAZ强2倍，优于PIPC/TAZ、CPZ/SBT。CAZ/TAZ1:1、2:1、4:1对产ESBLs的17株大肠埃希菌、39株肺炎克雷伯杆菌、10株醋酸钙不动杆菌的抗菌活性比CAZ强2～8倍，稍优于CAZ/TAZ8:1，强于PIPC/TAZ32～64倍、CPZ/SBT8～16倍。不同配比CAZ/TAZ对不产ESBLs的94株大肠埃希菌、71株肺炎克雷伯杆菌、10株醋酸钙不动杆菌的抗菌活性与CAZ相近，优于PIPC/TAZ、CPZ/SBT，但对醋酸钙不动杆菌的抗菌活性稍弱于CPZ/SBT。
   
　　不同配比CAZ/TAZ对65株产酶、9株不产酶铜绿假单胞菌的抗菌活性均与CAZ相近，MIC 50 值均为2mg/L，优于PIPC/TAZ、CPZ/SBT;对产酶的19株阴沟肠杆菌、18株产气肠杆菌、37株粘质沙雷氏菌的抗菌活性比CAZ强2～4倍，明显优于PIPCZ/TAZ，对阴沟肠杆菌、产气肠杆菌的抗菌活性与CPZ/SBT相近，对粘质沙雷氏菌的抗菌活性优于CPZ/SBT。
     
　　表1 CAZ/TAZ及其对照药对812株临床分离菌的MIC测定 （略）
    
　　3 讨论
    
　　三唑巴坦是大鹏药品工业株式会社首先合成的β-内酰胺酶抑制剂，是典型的不可逆竞争性β-内酰胺酶抑制剂，能有效抑制革兰阴性菌产生的各种质粒介导的β-内酰胺酶，对肺炎克雷伯杆菌、拟杆菌等产生的染色体介导酶及葡萄球菌产生的青霉素酶具有抑制作用，抑酶作用强于舒巴坦，与克拉维酸相近 ［1］ 。随着头孢类抗生素尤其第三代头孢类抗生素在临床上广泛应用，细菌耐药越来越多，近几年产ESBLs细菌尤其大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌报道不少，本文按照NCCLS规定的产ESBLs鉴别方法 ［4，5］ ，筛选了111株大肠埃希菌和110株肺炎克雷伯杆菌，得到产ESBLs的大肠埃希菌17株、肺炎克雷伯杆菌39株，产酶率分别为15.3%、35.5.8%，均低于文献报道 ［6］ ，这可能由于地区不同所致。不同配比CPZ/TAZ对产普通β-内酰胺酶的110株大肠埃希菌、110株肺炎克雷伯杆菌、74株醋酸钙不动杆菌的抗菌活性比CAZ强2倍，但对产ESBLs的大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、醋酸钙不动杆菌的抗菌活性比CAZ强约4～8倍。
   
　　为确定头孢他啶与三唑巴坦的配比，本文研究了头孢他啶/三唑巴坦1:1、2:1、4:1、8:1对812株临床分离菌的体外抗菌活性，结果表明头孢他啶与三唑巴坦的配比在1:1～4:1之间抗菌活性相近，8:1抗菌活性稍减弱。提示在开发头孢他啶与三唑巴坦复方制剂时，最佳配比是4:1，其次也可以考虑8:1，最终确定配比需要进行抑酶试验和体内试验。
   
　　总之，三唑巴坦与头孢他啶的配合使用，增强了头孢他啶的抗菌活性，头孢他啶/三唑巴坦1:1、2:1、4:1、8:1均有较强的抗菌活性，明显优于头孢他啶，值得进一步开发研究，尤其头孢他啶/三唑巴坦4:1复方制剂。
    
　　参考文献
    
　　1 Gutmann L，Kitzis MD，Yamabe D，et al.Comparative evaluation of a newβ-lactamase inhibitor，YTR-830，combined with differentβ-lactam antibiotic against bacterial harboring knownβ-lactamase.An-timicro Agents Chemother，1986，29:955-957.
   
　　2 Padayatti PS，Helfand MS，Totir MA，et al.Tazobactam forms a stoi-chiometric trans-enamine intermediate in the E166A variant of SHV-1beta-lactamase:1.63A crystal structure.Biochemistry，2004，43（4）:843-848.
   
　　3 Amyes SG，Baird DR，Crook DW，et al.A multicentre study of the in-vitro activity of cefotaxime，cefuroxime，ceftazidime，ofloxacin and ciprofloxacin against blood and urinary pathogens.J Antimicrob Chemother，1994，34（5）:639-648.
   
　　4 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically;Approved Standard-Sixth Edition.NCCLS，2003，M7-A6Vol.23No.2.
   
　　5 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;Thir-teenth Informational Supplement.NCCLS，2003，M100-S13.
   
　　6 Xiong Z，Zhu D，Wang F，et al.Investigation of extended-spectrum beta-lactamase in Klebsiellae pneumoniae and Escherichia coli from China.Diagn Microbiol Infect Dis，2002，44（2）:195-200.
   
　　* 基金项目:国家十五重大科技专项资助项目（2003AA2Z347D）、国家自然科学基金资助项目（30472058）
   
　　作者单位:100050中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所（ △ 通讯作者）