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454Hospital of PLA，Nanjing210002，China
【Abstract】 Objective It is one of the most important host-versus-graft reaction（HVGR）of T cell-mediated immunity in the rejection of transplantation.For inhibit HVGR of allomycardium transplantation，we tried to induce specific immune to tolerance byT cell vaccination.Methods and Results （1）The vaccines were prepared by activat-ing alloantigen-immunised mice T cell with concanvalin A（Con A）or CD 3 McAb could dramatically prolong the sur-vival of transplanted allomyocardium（P<0.01）.（2）After T cell vaccination，it was confirmed in vitro that anti-idio-type cells were induced and they have the ability to regulated immunal network to achieve specific tolerance to specific allograft myocardium.（3）Histopathological examination indicated that infiltration lymphocytes of decreased obviously in transplanted allomycardium after T cell vaccination.Conclusion The results of the studies preliminary demon-strate:T cell vaccination enable to allomycardium of transplantation to survive longer and calculated it would provide a novel way for inhibiting transplantation rejection.
【Key words】 allomyocardium;transplantation rejection;T cell vaccination
机体免疫系统是由多种免疫细胞和细胞因子组成的网络系统，细胞和细胞之间通过个体基因型、抗个体基因型、辅助及抑制等作用方式相互制约和调节。在正常机体中，一些针对自身或同异种抗原的T淋巴细胞受到上述机制的控制，维持在很低水平，一旦受同种、异种、有丝分裂原或某种特定情况下的自身抗原刺激使免疫活性细胞得以活化、增殖产生免疫效应。因此要抑制宿主抗移植物反应（host-versus-graft reaction，HVGR），特异性的抑制反应T细胞的活化增殖，使机体对移植物产生免疫耐受，可能是一种理想的方式 ［1］ 。我们根据T细胞免疫接种可特异性恢复机体对某自身抗原的免疫耐受的原理与方法 ［2，3］ ，试图用具有一种小鼠抗原特异性T细胞疫苗主动免疫与之不同品系小鼠，观察免疫小鼠同种心肌移植物存活时间的改变。
1 材料
1.1 动物 BALB/c（H-2 d ）雄性18～22g，C 57 BL/6（H-2 b ）雄性18～22g，C 3 H（H-2 K ）雄性18～22g，新生20h内C 57 BL/6（H-2 b ）性别不分。
1.2 主要实验 大鼠抗小鼠淋巴细胞单克隆抗体（McAb）CD 4 （L 3 T 4 ）McAb、CD 8 （Lyt-2）McAb和CD 3 （Thy-1）McAb（Case Western Reserve大学郭亚军博士惠赠）。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的羊抗大鼠Ig（第四军医大学免疫教研室）。丝裂霉素C（日本）。刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、RPMI1640、胰岛白酶（Sigma公司）。氚标记的胸腺嘧啶核苷酸（ 3 H-TdR）（中国同位素总公司）。
1.3 主要仪器 同位素液闪仪（Beckman Ls9800型）、心电图机（日本Kenz-FECG-103型）、CO 2 培养箱（德国Hearue公司），荧光及倒置显微镜（Olympus公司）。
2 方法
2.1 同种抗原特异性T细胞疫苗的制备 取C 57 BL/6鼠脾细胞，在200目不锈钢网上磨碎，0.83%NH 4 Cl溶解红细胞，洗涤3次（1000转/min，每次5min），用含25μg/ml丝裂霉素C与37℃水浴处理45min，洗5次，尾静脉注射BALB/c鼠，细胞数为1×10 7 /只0.2ml，9天后加强免疫1次（方法同前），7天后取免疫BALB/c鼠脾、胸腺和淋巴结，制成3×10 6 /ml的含10%同系灭活血清或含15%灭活小牛血清（FCS），2μg/ml ConA CD 3 McAb的PRMI1640细胞悬液。5%CO 2 ，37℃培养48h，取这种活化的淋巴细胞，用25μg/ml丝裂霉素C处理（37℃水浴45min）或用0.3%戊二醛室温下处理15min，PRMI1640洗细胞5次，制成5×10 7 个/ml PRMI1640细胞悬液，每只BALB/c鼠尾静脉注射1×10 7 个细胞。
2.2 心肌移植手术及心电图观察 参照Judd KP报道的方法 ［4］ ，受体BALB/c鼠经乙醚麻醉后，在耳壳背面皮下制备一小囊腔。取新生20h内的C 57 BL/6小鼠心脏，置于装有PRMI1640无菌培养皿中，让其自动收缩5秒，排尽其中血液，再用手术刀将心脏切成均等的两半，将其中的一半移植至受体鼠耳皮下小囊内，排出囊内的空气以及液体，术后第5天，用心电图机测移植部位心电活动，无心电者为手术失败者，不列入实验观察数据，以移植心肌的心电活动消失作为心肌存活的终点。
2.3 抗同种抗原特异性T细胞增殖抑制实验 参照Lider O等报道的方法 ［2］ ，将经T细胞疫苗免疫BLAB/c鼠的淋巴结、胸腺淋巴细胞作为反应细胞。C 57 BL/6鼠、C 3 H或未经免疫BALB/c鼠脾细胞作为刺激细胞，用25μg/ml丝裂霉素C37℃45min处理后，分别与反应细胞以等量的细胞数（5×10 5 个/ml）混匀，取此细胞悬液加入96孔板中，每孔0.2ml置CO 2 培养箱培养12h，取出再加入 3 H-TdR20μl（1μCi），继续培养18h，用细胞收集仪收集在49型玻璃纤维纸上，并用蒸馏水冲洗，干燥后置液闪液内，在液闪仪上测其放射性，结果用液闪仪每分钟记录脉冲数（cpm）表示。
2.4 T细胞疫苗表面标记测定 将用作疫苗的T淋巴细胞，制成浓度为1×10 6 个/ml的细胞悬液，分别加入大鼠抗小鼠CD 4 、CD 3 McAb为一抗，用正常小鼠血清作阴性对照，4℃60min，洗3次（1200r/min，每次5min），重悬细胞，加入FITC标记羊抗大鼠IgG作为二抗，30min，洗3次，在荧光显微镜上观察，计阳性细胞的百分数。
2.5 移植心肌的病理观察 在移植心肌的心电活动消失时“心肌存活终点”作心肌移植部位鼠耳的常规病理石蜡切片，HE染色。
2.6 实验数据的统计学分析 本实验数据用ˉx±s表示，用SPSS11.0统计软件作one-way analysis of varrance分析，均数间进一步作Q-test分析，P<0.05有统计学意义。
3 结果
3.1 T细胞疫苗抗同种心肌移植排斥反应不同的诱生剂诱得T细胞疫苗对同种移植心肌存活时间的影响有所不同 ConA或CD 3 McAb激活的T细胞疫苗经丝裂霉素C处理后，抗移植排斥反应效果较佳，而前者又大于后者（P<0.05），用丝裂霉素C处理的T细胞疫苗的效应强于戊二醛（P<0.05），而各治疗组与对照组比较均有效，它们之间比较有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表1 T细胞疫苗对同种心肌移植的作用（略）
注: * E VS.other groups * P<0.05;D vs.A，B and C Δ P<0.05;C vs A and B # P<0.05
3.2 T细胞疫苗的表型 ConA诱导经同种抗原免疫鼠的T细胞后，测得这中T细胞表型CD 4 与CD 8 细胞之比为1.48±0.51，而抗CD 3 McAb诱导同种抗原免疫的小鼠T细胞的CD 4 与CD 8 细胞的比值为2.13±0.41。这表明ConA诱生的CD 8 细胞所占的百分比大于抗CD 3 McAb（P<0.05）所诱生的数量（图1）。
3.3 抗同种特异性抗原淋巴细胞增殖抑制 受体抗C 57 BL/6鼠特异性T细胞接种BALB/c鼠脾细胞、淋巴结和胸腺混合淋巴细胞，可对来自C 57 BL/6鼠的脾细胞比其它同种鼠C 3 H的脾细胞表现出特异性的增殖抑制作用（P< 0.05）。而未经这种T细胞接种者，则无此作用，差别无统计学意义（见表2）。
图1 T细胞疫苗表型分析（略）
表2 T细胞接种鼠抗原特异性淋巴细胞增殖抑制（略）
注:组间比较差异有显著性
3.4 移植心肌的病理观察 移植心肌在心电活动终点的常规病理切片可见，对照组在移植心肌部位有大量的淋巴细胞浸润，大部分心肌细胞受损，而T细胞接种组心肌细胞周围浸润的淋巴细胞较少（图2）。
（图2见封三）（略）
4 讨论
在同种移植中，采取有效措施预防和抑制排斥反应以保护移植物，是移植免疫学研究的中心内容。延长移植存活时间的措施，首先应是供受者之间主要组织相容性抗原（major histocomatibility antigen，MHA）高度一致，但这种抗原系统非常复杂及多样，要获得完全配合，在实际中这种可能性是微乎其微。因此，临床上目前多以适当的使用一些非特异性的免疫抑制剂如CsA、FK506等作为延长移植物存活的时间的主要手段。近年来一些学者认识到诱导机体免疫系统自身调节机制、减少特异性的以移植物作为靶细胞的T淋巴细胞的分化、增殖，使其对移植器官产生特异、持久的免疫耐受，是抗移植排斥研究的发展方向 ［5，6］ 。
在自身免疫性疾病的研究中，T细胞疫苗能有效地阻止此类疾病的发生或减轻其症状 ［2，3］ 。我们借用此原理应用T细胞接种技术，抗同种心肌排斥反应有一定的疗效。其中不同的诱导物所激活的T细胞疫苗在抗同种心肌移植排斥反应时强度不一，ConA的效应大于抗CD 3 McAb，这可能因为短时间内（72h）丝裂原ConA的T细胞的刺激作用要强于抗CD 3 McAb。在T细胞疫苗处理上，丝裂霉素C处理组的效果又强于戊二醛组，且这些有效的T细胞疫苗治疗组能显著地减少淋巴细胞对移植心肌部的浸润破坏。即使在心电活动终点时仍有生长良好的心肌细胞存在，还有沿鼠耳壳生长的，此时，我们没有测到心电可能是因为心肌细胞分散生长，心电活动也不同步有序的原因。未经激活的T细胞疫苗无作用，只有ConA等诱导物激活的T细胞疫苗，给动物接种后方能产生预防自身免疫性疾病的发生和减轻病情。我们的结果也说明只有经诱导激活的T细胞疫苗才能有效地延长移植物的生存期。其机制可能是由作为疫苗的抗同种特异性抗原的T淋巴细胞表面的抗原受体，是机体产生抗个体基因型的T淋巴细胞 ［5，7］ 。我们的体外淋巴细胞增殖抑制实验也显示，经过针对C 57 BL/6的特异性T细胞疫苗免疫的BALB/c鼠的淋巴细胞，能对C 57 BL/6淋巴细胞产生特异性的耐受。虽然这种特异性的耐受仅是相对其它品系鼠的淋巴细胞而言，比起其自身淋巴细胞的无反应性来说还存在差异。这种具有抗同种特异性抗原的T淋巴细胞被激活制成的T细胞疫苗，接种将会产生抗个体基因型T细胞克隆群与Lider O等报道的T细胞疫苗接种对自身免疫性疾病实验性脑脊髓炎的模型中涉及到的由抗个体基因型T细胞介导的独特型与抗独特型网络机制治病的原理基本一致 ［2，3］ 。
总之，虽然我们应用T细胞疫苗抗同种心肌移植排斥反应能有效地延长同种心肌的存活时间，且T细胞疫苗的制备比文献所报道的自身免疫病的T细胞疫苗的制备方法要简捷些，但从疗效来看，与我们所期望的相差较远，因此我们有必要进一步寻找更好的动物模型，既可在体外诱导出特异性更强的T淋巴细胞作为疫苗，而又易于观察其疗效并便于我们研究T细胞疫苗的各种特性和其抗移植排斥的机制，为探索一种高效、特异、无毒的抑制移植排斥反应的新方法提供更好的依据 ［5，8］ 。
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作者单位:210002江苏南京，解放军第454医院