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【摘要】 核心组蛋白的乙酰化状态影响基因的转录、DNA的复制和修复，是生理、病理的生化基础，组蛋白脱乙酰酶抑制剂因改变核心组蛋白的乙酰化状态，对肿瘤、心脏病和某些原虫病具有治疗作用。本文介绍组蛋白的分子生物学，包括其分类、结构、催化机制，以及组蛋白抑制剂的种类、作用机制的新进展。
【关键词】 组蛋白脱乙酰酶；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；靶标
真核生物的DNA缠绕于组蛋白上形成核小体，核小体进一步缠绕形成染色质，组蛋白的修饰对基因的转录、DNA复制和修复起着重要的调节作用，包括甲基化、磷酸化、乙酰化等。其中，组蛋白的乙酰化状态由一对功能活跃的组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）催化进行，近年来发现一些有机物分子能竞争性抑制HDACs而影响组蛋白的乙酰化状态，从而发挥治疗肿瘤、心脏病、某些原虫病的作用，HDACs由此而成为药物作用的新靶标。
1 HDACs的分子生物学特点
HDACs属于脱乙酰酶超家族，因能抑制基因的表达，曾有一些成员被鉴定为转录的辅阻遏物，自从Schreiber（1996）等首次证实与酵母的转录辅阻遏物yRPD3基因同源的cDNA产物是HDACs开始，HDACs就与转录阻遏物和辅阻遏物联系在一起，此后迅速建立了HDACs分类系统，并不断发现新成员。目前对酵母和人的HDACs研究最多，Gregoretti等［1］对许多物种在册的HDACs相关蛋白的种系发生分析（Phylogenetic Analysis）表明，HDACs可分为4类：I类包括HDAC1～3、8，又称yRPD3-like，与yRPD3有60%的同源序列；II类包括HDAC4～7、9、10，与酵母的HDA1同源；III类包括SIRT1～7，与酵母的sir2同源，又称作sirtuin；IV类包括HDAC11，此前HDAC11被归入I类。酵母的HDACs通常使用原来作为转录调节因子的名称，如I类HDACs包括Rpd3、Hos1、Hos2，II类HDACs包括HDA1、Hos3，III类HDACs包括sir1～4。其他真核生物的HDACs在近几年也引起广泛的研究，在一些文献中为区别不同物种间的HDACs，常以代表物种学名的小写第一字母在HDACs前标识，如用m（murium）、d（drosophila）、h（human）标识鼠、果蝇、人的HDACs。3类HDACs的功能与其他几类明显不同，Sir的功能主要是使一些基因（酵母接合型座位、端粒、rDNA重复序列）沉默，以至于被称作scilent information regulator（sir），所以又可以把I、II、IV类称作非sirtuin类。目前人类HDACs的氨基酸序列、分子量、基因座位都已基本清楚，大多数的基因结构也已基本阐明。它们的分子功能域特点是一般都包含保守的C端催化结构域，又称核心保守结构域，许多分子间具有保守的N端调节结构域。在I类和II类HDACs，催化结构域含有与Zn2+螯合的保守氨基酸残基（如His）；在Ⅲ类HDACs，除具有与Zn2+螯合的保守残基外，还有与氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核甘酸（NAD+）结合的保守结构。调节结构域具有Cys等保守残基，是接受磷酸化、泛素化等修饰的位点（图1）［2］。经修饰的HDACs可与自身或其他HDACs以及转录调节因子相互作用，募集到组蛋白附近，催化核心组蛋白脱乙酰化或与DNA结合，影响DNA的转录、复制和修复。
图1 与酵母HDA1(Hdal)同源的HDAC4。
2 HDAC的募集与催化机制
HDACs对核心组蛋白的脱乙酰化作用受到许多因素的影响，许多蛋白复合物可与HDACs结合，调节HDACs的募集和在细胞内的定位，如蛋白复合物Sin3、RbAp46/48、NuRD(NRD)Mi2（Mi-2为一种ATP酶）和CoREST能与HDAC1/2结合，HDAC4和HDAC5在肌细胞的表达特别活跃，它们能与辅阻遏物NcoR和SMRT相互作用，特别是能与MEF2结合，涉及肌细胞的分化和细胞增殖。此外，HDAC4和HDAC5被证明能与HDAC3结合，一个研究表明磷酸化的HDAC4和HDAC5可被14-3-3蛋白结合而滞留于细胞浆不能转移到细胞核与HDAC3结合，结果不能抑制基因的转录［3］。III类HDACs以其能使基因沉默而倍受关注，它们也以复合物的形式发挥作用，如sir2/sir4/sir3复合物介导芽殖酵母结合型座位和端粒基因的沉默以及含有sir2的RENT复合物介导的rDNA重复序列的沉默［4］。除上述的复合物外，HDACs的募集、催化作用以及参与转录因子的调节作用还需要许多因子参与完成，HDACs也不仅是催化作用，把它们看作转录调节因子的一种类型更为合适。组蛋白乙酰化的位点在于核心组蛋白暴露在外的Lys残基上的ε氨基。经过修饰可直接改变染色质的结构，并且因组蛋白正电荷降低使染色质变得松弛以利于调节因子结合其上调节DNA的转录。经修饰的部位需要恢复原来的形态结构，包括由HDACs催化，脱去乙酰基，才能维持基因的正常表达和正常的细胞周期。所以HDACs对染色质重建和基因转录的调控是必需的。一些病理性因素导致基因表达异常使细胞周期失控而使细胞恶性增殖或产生病理性代谢紊乱，又可通过干扰组蛋白的乙酰化状态达到治疗的目的，HDACs抑制剂的发现正是这种机制的应用；HDACs对原虫病的治疗则是干扰正常组蛋白的乙酰化状态。HDACs是一类锌金属酰胺酶，催化乙酰化组蛋白脱乙酰基时锌离子跟乙酰基上的O水合物（-OH）螯合形成过渡态。I类和II类HDACs催化时这种过渡态的形成已被观察到；Ⅲ类HDACs也含有锌离子保守位点，但其脱乙酰作用需要NAD+作为乙酰基受体，反应过程形成酶-底物-NAD+三元复合物，产物之一是2’-O-乙酰-ADP-核糖。这是被阐明不久的催化机制，Ⅲ类HDACs被称作NAD+依赖性脱乙酰酶［5］。
3 HDACs抑制剂及其作用机制
已知的I类和II类HDACs抑制剂是具有与乙酰化赖氨酸残基侧链相似或相同的化学结构，包括短链脂肪酸类、氧肟酸类、环四肽类、苯甲酰胺及其类似物等，天然的HDACs抑制剂已有十几种之多，加上人工合成类似物，这些抑制剂达几十种，且不断有新抑制剂的报道。因多数HDACs抑制剂具有抗肿瘤的作用，故引起极大的研究兴趣。它们通过功能基团也能与HDAC的Zn2+形成螯合物，所以是HDAC的竞争性抑制剂。按功能基团的差异对它们进行分类是更合理的方法（表1），短链脂肪酸的羧基、氧肟酸类的氧肟酸根是官能团；环四肽类有的含有氧肟酸基，有的则含有环氧化物或酮基作为官能团，有不少合成的HDACs抑制剂以酰胺基作为官能团，还有一些HDACs抑制剂的功能基团由酮基和环氧化物构成。具有两个环氧酮结构的depudecin，其官能团可能是这两个环氧酮基，也可能是羟基与相邻的环氧酮基构成功能基团。抑制剂的其他基团和分子结构影响它们与HDACs结合的特异性和亲和力，如短链脂肪酸类、氧肟酸类的TSA和SAHA对I类和II类HDACs有广泛的抑制作用，而HDAC6对具有酮基结合环氧酮基为官能团的TPX有很高的耐性，苯甲酰胺的类似物MS275对HDAC1的抑制作用远强于对HDAC3的作用，而对HDAC8则没有抑制活性［6］。根据对催化机制和抑制剂模拟底物的了解，人工合成的抑制剂往往有更高的活性。抑制剂对I类和II类HDACs作用产生抗病效果，特别是抗肿瘤作用引起了广泛的研究，SAHA、丁酸、缩肽FK228、CI994等多种抑制剂已进入临床I期或II期试验，估计一两年内这类抑制剂应用到临床就会有初步的结果。抗肿瘤的机制是抑制剂使某些部位的核心组蛋白高度乙酰化，导致一些基因的启动子激活，致使与细胞周期有关的蛋白得到表达，结果使肿瘤细胞出现增生停止、分化、凋亡、转移抑制等变化，1个抑制剂能产生其中之一到全部的变化。HDACs抑制剂对心脏病疗效也开始引起人们的关注。 hop（属于JAK家族）的过度表达通过抑制血清应答因子（SRF）的活性导致心肌肥大，其机制是hop募集含有HDAC2的复合物影响相应基因的表达［7］，而TSA可减弱体外培养的心肌细胞的肥大已得到证实，研究中检测到TSA上调了α肌浆球蛋白重链的表达和下调了微管蛋白的表达［8］。近年来的研究表明HDACs抑制剂还可治疗炎症性疾病，如溃疡性结肠炎、风湿性关节炎、红斑狼疮、内毒素血症和肝损伤等，调节的分子机制还很不明确，似乎跟减少炎性介质（如IL-8、NO）的产生有关，也意味着与NF-κB的抑制有关［9］。III类HDACs跟生物体的生长、发育和寿命延长的调节密切相关，有关它们抑制剂的研究尚少，已有的结果表明尼克酰胺通过结合与NAD+邻近的部位阻止NAD+的水解而达到抑制酵母的sir2和人的SIRT1的脱乙酰化作用［10］。这是非竞争性抑制，与前述的抑制方式不同。另外Grozinger等［11］用表型筛选（phenotypic screen）的方法发现3个包含羟基萘醛及其衍生物的酵母sir2和人SIRT2的抑制剂（sirtinol、A3、M15），它们都具有平面的芳香族的结构，似乎还是与NAD+有关，且对3类HDACs表现特异性。之前的研究表明这些化合物（包括具有芳香性的splitomicin及其类似物）会干扰拟南芥体轴的发育；现有报道［12］，在婴儿利什曼原虫的体外培养中，sirtinol抑制无鞭毛体型虫体的增殖，而对前鞭毛体型虫体无影响。Apicidin（见表1）等一些I类和II类HDACs抑制剂既具有抗肿瘤作用又有抗原虫作用，抗原虫作用是对正常生理生化过程的干扰，目前还不知其靶标是I类和II类还是III类HDACs。根据后者的功能可以推测其靶标应是后者，但已有的研究表明后者对TSA不敏感（Imai，2000）。若靶标是后者，其机制是竞争性抑制的还是通过NAD+的非竞争性抑制仍有待研究。
表1 HDACs抑制剂的官能团
4 小结与展望
通常认为组蛋白乙酰化激活基因表达，而HDACs与基因沉默相关，事实上HDACs也能激活基因。HDACs对基因的调节虽然重要，但所调节的基因只是一小部分，估计占全部基因的2%～9%，对基因的调节既有激活也有抑制；既能催化组蛋白脱乙酰化也能催化非组蛋白脱乙酰化，这与其作为古老的有机分子广泛存在于物种之间且至少有些定位于细胞浆的事实相符，而且还参与多种蛋白的相互作用，所以从进化的角度来看待其功能也许更容易了解其在生理与病理过程中所起的作用。HDACs抑制剂的特异性研究是了解与HDACs调节相关的生理和病理作用的重要方法，也是筛选药物的基础，目前这方面的研究逐渐增多。另外，HDACs种类多，在体内和细胞内的表达和分布不一致，涉及相互作用的蛋白也很多，这些因素都影响抑制剂的作用，有待深入研究。缩写：SMRT，Silencing Mediactor for Rtinoid and Thyroid Receptor; N-CoR，Nuclear Receptor Corepressor; NuRD(NRD)，Nucleosome Remodeling and Deacetylating; Sirtinol，Sir Two Inhibitor Napthol; SAHA，Suberoylanilide Hydroxamic Acid; MEF，Myocyte Enhancer Factor; CtBP，C-terminal binding protein; CoREST，Corepressor to the REST (RE1 silencing transcription factor/neural restrictive silencing factor); RbAp，Retinoblastoma-Associated protein; RENT，Regulator of Nucleolar silencing and Telophase exit； JAK，Janus Kinase.
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(编辑：邓 锋)
作者单位： 1 528231 广东佛山，佛山科学技术学院生命科学分院
510642 广东广州，华南理工大学生物科学与生物工程学院
510642 广东广州，华南农业大学兽医学院