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灵芝，通常称为灵芝草，为多孔菌科紫芝或赤芝的全株，在祖国医学中被列为上品药材［1］。它含有多种有用的成分，如三萜类、多糖、麦角甾醇、葡萄糖氨、生物碱、水溶性蛋白质、顺蓖麻酸、延胡醇和黄酮类等生物活性物质。具有滋补强身、安神止痛等多种功效。本实验选择一种肝癌细胞，着重研究其作用的诸多方面，包括细胞生长、凋亡的诱导作用等。
1 材料与方法
1.1 材料 双灵固本散由上海绿谷（集团）公司生物医药研究所提供。该产品是由赤芝全草（ganoderma lucidum karst）和多种辅料经上海绿谷（集团）公司生物医药研究所特殊萃取加工而成；肝癌细胞BEL-7402、BEL-7404由中科院细胞所提供，1640完全培养液（Bibgo公司+卡那霉素+青霉素+链霉素+10%小牛血清），37℃，5%CO2进行培养；TS和CX引物由上海生工公司合成；Taq酶、dNTP由上海生工公司购入供给；PCR仪为GeneTchne公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞生长抑制测定［2，3］ 细胞（浓度104）接种于96孔培养板，每孔90μl。实验分5组进行，每组设3个复孔，第一组为无药物对照组，其他四组为不同药物浓度组。将双灵固本散粉剂用培养液溶解稀释成1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml四个浓度加入4组的药物组，每孔10μl。37℃、5%CO2条件作用72h后，D-Hank′s液洗涤2次，每孔加100μl含0.2mg/ml MTT的D-Hank′s液，37℃温育4h，去除MTT液，加200μl碱化DMSO（90% DMSO,0.1mol/L甘氨酸-NaOH,pH10.0），37℃温育30min并不时摇动，于酶标仪上读取630nmOD值（碱化DMSO液调零）。实验进行3次，结果基本一致，取3次的平均值计算抑瘤率，公式如下：抑制率＝100%×（对照组OD值－试验组OD值）/对照组OD值。
1.2.2 细胞凋亡光镜观察 细胞接种于位于24孔培养板中的盖玻片小条内，培养24h后，于次日加入相应的药物（药物浓度分别为10mg/ml和20mg/ml），试验设不加药物的作为对照组，作用48h后，取出盖玻片，GIEMSA常规染色，于OLYMPUS显微镜下观察。
1.2.3 细胞凋亡电镜观察 (1)扫描电镜样品观察：分别将对照组和实验组的细胞接种于放有盖玻片的培养皿内，培养48h后用D-Hank′s洗涤，2.5%/PBS戊二醛固定4h后，吸出戊二醛，洗涤后继续再加入2.5%/PBS戊二醛固定过夜，再换成PBS于4℃恒温箱中保存待用。用HITACHISEM-250型扫描电镜进行观察和拍照。
(2)透射电镜观察：对照组和实验组的细胞接种于50ml的培养瓶中，48h后收集实验细胞，D－Hank′s离心洗涤3次后用2.5%/PBS戊二醛固定4h后，吸出戊二醛，洗涤后继续加入2.5%/PBS戊二醛固定过夜，再换成PBS于4℃恒温箱中保存待用。用JEOS透射电镜观察。
1.2.4 对细胞端粒酶的作用 收集细胞，以冰预冷的洗涤缓冲液（10mmol/L HEPES-KOH,1.5mmol/L MgCl2,10mmol/L KCI,1mmol/L DTT,pH7.5）离心洗涤3次，加100μl预冷的裂解液（10mmol/Ltris-CI,1mmol/L MgCl2,1mmol/LEGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/L β-巯基乙醇，0.5% CHAPS,10%甘油，pH7.5）冰上裂解30min，4℃，15000rpm离心15min取上清液。
TRAP法进行端粒酶的扩增方法如下：
于冰浴中建立反转录体系，50μl体系中含20mmol/Lreis-CI,pH8.3,1.5mmol/L，MgCl2,63mmol/LKCl,1mmol/LEGTA,50umol/LdNTPs,0.005%Tween20,0.1mg/mlBSA,2uTaqDNA聚合酶，4μl端粒酶提取物，100pmolTS引物，100pmolCX引物，以DDW补齐体积，其中CX引物与体系中其他成分用石蜡油隔开。22℃反转录30min后 ,90℃变性2min。PCR参数如下：94℃，30s；50℃，30s；72℃，1min30s，31个循环，后72℃延伸5min。扩增后产物于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，100V4～5h，入固定液（10%乙醇+0.5%乙酸）5min，蒸馏水振荡1min，染色液（1%硝酸银+甲醛）振荡20min，蒸馏水振荡洗涤3次，每次1min，显色液（3%NaOH+0.1%甲醛）振荡显色直至条带出现，固定液中固定，拍照。
2 结果
2.1 双灵固本散对细胞增殖的影响 见表1。
表1 双灵固本散对肝癌细胞BEL-7402增殖的影响（略）
从表1中可以看出，双灵固本散对肝癌细胞的抑制作用是比较明显的，但存在剂量上的差异，1mg/ml的剂量基本没有什么影响，而达到10mg/ml的时候，影响就比较显著，在20mg/ml的剂量下，已经超过50％的抑瘤率，可见在一定的剂量下，双灵固本散对肝癌细胞的抑制作用是明显的。
2.2 光学显微镜观察 经常规GIEMSA染色光镜观察，可见凋亡细胞膜完整或起泡，并有染色致密的凋亡小体形成，胞核染色质凝聚，或附于核膜，或形成致密，边缘清晰的凝聚块等可作为凋亡细胞的标志，在10mg/ml的剂量下，已经可见明显的凋亡细胞，而20mg/ml的剂量凋亡细胞已非常明显，可见，双灵固本散对肝癌细胞确有明显的诱导凋亡作用。
2.3 扫描电子显微镜观察 在扫描显微镜下，对照组各类细胞的表面均存在丰富的微绒毛；在细胞边缘出现较多的伪足，其中球形细胞较多而扁平细胞较少；但经双灵固本散处理的细胞，细胞表面的微绒毛较少，长度缩短，伪足减少，其特征与对照组细胞存在明显的差异。
2.4 透射电子显微镜的观察 透射电镜观察显示，对照组细胞的核质比较大，核形状不规则，核仁大且多样，小泡较多；在胞质内内质网和高尔基体等不发达，线粒体不规则。而处理组的细胞超微结构发生了明显的变化，核质比例减少，核形状圆形或卵圆形，核仁变小；胞质内内质网和高尔基体等增多，线粒体多呈圆形和棒状，其特征与对照组存在明显的差异。
2.5 肝癌细胞端粒酶实验的结果 由电泳的结果可以看出，对照组的端粒酶活性很强，有很多连续的梯形条带；而实验组的端粒酶的活性随着加入双灵固本散药物浓度的增加而活性受到明显的抑制。
结论：从上面几方面的实验结果看，双灵固本散对肿瘤确有较强的抑制作用，并且能明显引起肝癌细胞凋亡。
3 讨论
关于双灵固本散对体外培养细胞的作用情况，已经有比较多的工作，但我们的实验首次比较系统地研究了其对于一种细胞多方面的研究。从实验结果来看：(1)对于细胞内关键酶的作用情况，加入双灵固本散一起培养的肝癌细胞内的端粒酶和对照组比较，实验组的端粒酶活性受到了明显的抑制，端粒酶的活性被认为同细胞的癌变有很密切的关系。(2)从形态学的角度来看，由电镜扫描及切片后在电镜下观察发现肝癌细胞有一部分在双灵固本散的作用下变成了正常细胞，一部分发生凋亡，并且凋亡和逆转的细胞总数随着所加双灵固本散的浓度提高而提高，受作用组的细胞和细胞器的形态已较大程度地恢复到正常，值得注意的是，在我们的透射电镜观察中，一些灵芝孢子进入到细胞里面去了，是否灵芝孢子真的能够被细胞所吞食，这个现象还需要进一步的证实。(3)从细胞增殖的角度来说，20mg/ml的双灵固本散可以对肝癌细胞有较好的抑制作用。
总之，尽管有许多现象还有待于进一步研究解释，但双灵固本散导致肝癌细胞的凋亡和逆转作用是肯定的。
(致谢：本课题研究得到了上海绿谷生物医药研究所所长陈金生教授的大力协助。)
【参考文献】
1 江苏新医学院《中药大辞典》编写组.中药大辞典.上海：上海科学技术出版社，1999，1180-1182.
2 周红，颜青.Isoverbascoside对HL-60细胞生长和超微结构的影响.癌症，1997，16（1）：29-31.
3 王振义，陈竺.肿瘤的诱导分化和细胞凋亡法.上海：上海科技出版社，1998，117.
4 Suh YA, Arnold RS, Lassegue B, et al. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl.Nature,1999，401(6748):79-82.
5 Kheradmand F, Werner E, Tremble P, et al. Role of Racl and oxygen radicals in collagenase-expression induced by cell shape chance. Science,1998,280(5365):898-902.
6 Okabe S, Suganuma M. Mechanisms of growth inhibition of human lung cancer cell line, PC-9, by tea polyphenols. Jpn J Cancer Res，1997,88(7):639-643.
(编辑：汪 洋)
作者单位： 200436 上海，上海大学生命科学学院