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【摘要】 目的 研究HBcAg、HBsAg刺激HBV慢性感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)分泌IFN-γ。方法 选择转氨酶升高的HBV免疫清除期患者及转氨酶正常的HBV免疫耐受期患者各16例，体外用HBcAg、HBsAg刺激PBMCs，并以1640培养基作为对照，用酶联免疫斑点(enzyme link immunal spot, ELISPOT)方法检测PBMCs分泌IFN-γ的免疫反应。结果 与1640刺激的对照相比，HBcAg刺激PBMCs分泌IFN-γ, 14例(87.5%)免疫清除期患者为阳性，而所有免疫耐受期患者为阴性，二者之间差异有非常显著性(P=2.55×10-7)。结论 HBcAg刺激PBMCs分泌IFN-γ的反应，HBV免疫清除期与免疫耐受期患者不同，而HBsAg的刺激则没有差异。
【关键词】 HBV慢性感染者； PBMCs ； HBcAg；HBsAg刺激； IFN-γ分泌； ELISPOT
The effect of HBcAg，HBsAg on the production of IFN-γ of PBMCs from the HBV chronic carrier
ZHANG Lei,CHENG Yang-shu.The Forth People’s Hospital of ChenZhou, Chenzhou 423000,China
【Abstract】 Objective The production of Interferon-γ (IFN-γ) from peripheral blood mononucler cells (PBMCs) stimulated by HBcAg、HBsAg in chronic hepatitis B infection.Methods For the patients infected with HBV, 16 patients in clerance period(with the increased alanine aminotransferase), 16 patients in tolerance period(with the normal alanine aminotransferase), were affected. The PBMCs were stimulated with HBcAg and HBsAg separately to measure the production of IFN-γ by the method of enzyme link immunal spot (ELISPOT).Results In compare with the production of IFN-γ stimulated with 1640, those stimulated with HBcAg were significant higher for the 14 cases(87.5%) of patients in clerance period and no change for all of the patients in tolerance period.Conclusion The response of the production of IFN-γ stimulated with HBcAg for the patients in clerance period is significant different from those in tolerance period.
【Key words】 chronic infection with HBV； PBMCs； stimulation with HBcAg or HBsAg； production of IFN-γ； ELISPOT
乙肝病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是引起慢性肝炎的主要病因，并常常导致肝硬化及肝癌，目前全球有3亿HBV慢性感染患者，国内有一亿二千万。ＨＢＶ感染的多种临床表现形式和转归主要取决于感染者体内的抗HBV免疫反应的强弱，包括体液免疫和细胞免疫。所有HBV慢性感染患者体内都有抗HBV体液免疫反应，但并不能清除体内的HBV；大部分成年人感染HBV后表现为急性、自限性病程，机体免疫反应能够清除体内HBV，而只有部分感染者发展成为慢性携带者，HBV在体内持续复制，造成这一区别的原因是前者的抗HBV细胞免疫反应较强，而后者的细胞免疫反应较弱。按照细胞免疫反应强弱，可以对不同HBV感染者，进行分型：(1)免疫清除期，体内存在多克隆、多特异性、较强的细胞免疫反应，临床表现为血清转氨酶升高(正常值2倍以上)，机体免疫反应能清除体内HBV，不发展成为HBV慢性携带者；(2)免疫耐受期，体内细胞免疫较弱，不能清除体内HBV，临床表现为血清转氨酶正常或轻度增高(小于正常值2倍)，最终发展为HBV慢性携带者；(3)残留整合期，患者体内HBV含量较低，临床表现为血清转氨酶正常或轻度增高，体内细胞免疫较强，最终清除HBV；HBV感染的这种免疫分型对治疗HBV感染也有帮助，并有助于预测HBV感染的预后，目前治疗HBV感染药物—干扰素(interferon, IFN)及拉米夫定(lamivudine)只对抗HBV细胞免疫反应较强的、血清转氨酶升高的感染者有效。临床常常通过HBV感染者血清转氨酶水平判断其免疫分型，并不是直接检测其细胞免疫反应。本文用HBV感染者细胞免疫反应对其分型，并与常规的血清转氨酶水平分型方法进行比较。
1 材料与方法
1.1 对象资料 32例乙型肝炎感染者来自本院2003年9月～2004年5月期间门诊及住院病人，男20例，女12例；年龄19～42岁,平均31.7±8.2岁。符合1995年第五届全国传染病与寄生虫病会议修订标准。排除其他型别病毒性肝炎，按临床血清转氨酶分为转氨酶升高的HBV免疫清除期患者及转氨酶正常的HBV免疫耐受期患者，各16例，排除肝脏及其他重要器官病变，剔除同时感染、重叠感染及近期使用生物制品治疗者。
1.2 肝炎病毒标志物测定 采用ELISA方法，抗HAV-IgM、抗HCV-IgG、抗HDV试剂盒由中国预防医学科学院病毒所研制，乙型肝炎诊断试剂盒由亚培公司提供。
1.3 ELISPOT检测PBMCs受HBcAg、HBsAg刺激分泌IFN-γ的免疫反应 抗IFN-γ的单克隆抗体的包被液(100μl/孔，10μg/孔)包被96孔板(5μg/孔)，4℃过夜。用淋巴细胞分离液制备HBV慢性感染者PBMCs；用含3% BSA的1640培养液冲洗、阻断非特异性结合位点1h；以4×105/孔标准加入PBMCs，分别加入HBsAg(终浓度14μg/ml)，HBcAg(终浓度2μg/ml)，培养液分别作为阴性对照；每个浓度3个重复孔；37℃、5% CO2 培养19h。用10μg/ml 生物素标记的抗IFN-γ抗体37℃、5% CO2孵育2h。用PBS/0.05% Tween 20冲洗4次，加显色液(30μl/孔) 显色25min后用去离子水终止显色；冲洗、干燥后，在显微镜下计数。
1.4 统计学方法 分别用HBcAg、1640刺激产生的IFN-γ斑点数及其差值表示ELISPOT结果，差值大于15/孔为阳性，反之为阴性；免疫清除期、免疫耐受期二组患者ELISPOT结果比较用χ2精确法检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 HBcAg对PBMCs分泌IFN-γ的刺激作用 见表1。表1 HBcAg对PBMCs分泌IFN-γ的刺激作用表1表明免疫清除期及免疫耐受期患者PBMCs体外受HBcAg刺激后分泌IFN-γ的反应不同，前者较强，后者较弱，二者差异有显著性(P=2.55×10-7)；同时也发现，ELISPOT阳性的HBV感染者均是免疫清除期患者，但部分免疫清除期患者ELISPOT阴性，免疫耐受期患者ELISPOT均为阴性，表明用患者PBMCs体外受HBcAg刺激后分泌IFN-γ的细胞免疫反应鉴别免疫清除期及免疫耐受期，准确性较高(100%)，但存在假阴性(12.5%)。
2.2 HBcAg刺激患者PBMCs分泌IFN-γ与患者血清转氨酶相关性分析 相关系数r=0.663，P<0.05，表明ELISPOT斑点数与转氨酶有正相关，相关系数有统计学意义(P＜0.05)；若以ELISPOT斑点数应变量Y，转氨酶数值为自变量X，ELISPOT斑点数与转氨酶之间的直线回归方程Y=-2.432+0.753X，回归系数0.753的显著性检验，P＜0.05，常数-2.432的显著性检验P＜0.05，表明ELISPOT斑点数与转氨酶之间的直线回归关系有显著意义，ELISPOT斑点数与转氨酶之间的直线回归方程Y=-2.432+0.753X较适用，稳定性较好。
2.3 HBsAg对PBMCs分泌IFN-γ的刺激作用 见表2。表2 HBsAg对PBMCs分泌IFN-γ的刺激作用表2结果显示免疫清除期及免疫耐受期患者PBMCs体外受HBsAg刺激后分泌IFN-γ的反应差别不大，二者差异无显著性(P＝0.11)，大多是阴性，表明用HBsAg刺激PBMCs检测分泌IFN-γ的反应，并不能很好鉴别免疫清除期及免疫耐受期HBV感染者。
3 讨论
HBV是引起慢性肝炎的主要病因，并常常导致肝硬化及肝癌，一般HBV感染者体内均存在特异性抗HBV抗体，但这种体液免疫反应却不能清除机体内的HBV，HBV自限性感染者的抗HBV特异性细胞免疫反应较强，但同时伴有肝脏受损，血清转氨酶增高，国外将这部分称为免疫清除期，相对应的血清转氨酶正常、抗HBV特异性细胞免疫反应较弱、不足以清除体内HBV，使HBV感染慢性化，国外称之为免疫耐受期患者［1～3］。
免疫清除期患者体内存在抗HBV的多克隆、多特异性细胞免疫反应，包括CD 4+ 的I型辅助T淋巴细胞(T helper lymphocyte, Th1)分泌的细胞因子(IFN-γ,TNF-α,IL-2)产生的非细胞融解性抗HBV作用及CD 8+ 的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)对HBV感染肝细胞的细胞融解性抗HBV作用。研究发现，在淋巴细胞浸润肝脏组织达高峰之前，机体已开始清除体内的HBV，而且与IFN-γ分泌高峰的时相一致，提示Th1分泌的细胞因子产生的非细胞融解性抗HBV作用在CTL对HBV感染肝细胞的细胞融解性抗HBV作用之前即发挥作用，在肌体清除HBV过程中起着重要作用。研究证实，Th1淋巴细胞因子通过抑制肝细胞胞浆及肝细胞胞核的HBV共价、闭合、环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的复制，达到清除体内HBV、治疗HBV感染的作用,同时不引起HBV感染肝脏细胞融解性破坏。Th1淋巴细胞因子还可以通过调节CTL功能、抗HBV特异性抗体的产生，进一步清除体内的HBV，在机体清除体内HBV的免疫反应中起重要作用。而免疫耐受期患者，抗HBV特异性细胞免疫反应较弱。
国内外研究发现在肝炎病人的炎症区域有产生IFN-γ的细胞的积聚，并且肝组织中IFN-γｍＲＮＡ的表达同组织炎症有相关性。ＩＦＮ-γ除了具有增强机体抗病毒能力外 ,还具有重要的免疫调节作用，能在转录后水平抑制肝炎病毒，又能通过免疫调节来增强机体防御能力。国外报道，急、慢性乙肝患者外周血中的Ｔ细胞都以分泌ＩＦＮ-γ为主，且免疫清除期患者的Ｔｈ1、Ｔｃ1细胞高于健康对照组，健康对照组又高于免疫耐受期患者。同时发现Ｔｈ1、Ｔｃ1细胞随着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而逐渐增多，慢性重度组明显高于慢性轻度组、慢性中度组，Ｔｈ2、Ｔｃ2细胞比例在正常人和各组病例中差异无显著性。免疫清除期患者，机体的ＨＬＡ ＩＩ类抗原限制的ＣＤ4+Ｔｈ细胞应答功能是正常的，这种Ｔ细胞应答可以协助细胞毒性Ｔ细胞 (ＣＴＬ)的应答，从而直接或间接地增强ＣＴＬ细胞的活性，具有抗病毒活性的ＣＴＬ是彻底清除ＨＢＶ最重要的一环，大量分泌ＩＦＮ-γ的Ｔｃ细胞可能也与机体最终能成功清除病毒有关。Ｔｈ1细胞分泌的ＩＦＮ-γ能在转录后水平抑制肝炎病毒，又能通过免疫调节增强机体的防御能力。而免疫耐受期患者的免疫系统虽试图利用Ｔｈ1型细胞因子的抗病毒效应来抑制病毒复制并清除病毒，但它的Ｔｈ1型细胞因子的量不足，机体不能彻底清除病毒，只能降低病毒载量。
对ＩＦＮ-α或拉米夫定抗病毒治疗应答(免疫清除期)的患者，其ＨＢＶＤＮＡ阴转，分泌ＩＦＮ-γ的Ｔ细胞也升高，甚至高于健康对照组。因此，检测Ｔｈ1、Ｔｈ2类细胞因子的变化，可预测患者对抗病毒治疗的反应，对及时判断药物的疗效、指导药物的临床应用有重要意义。
正常情况下，转氨酶存在于肝细胞内，在肝细胞受损时释放出来。笔者的研究显示，转氨酶升高的免疫清除期患者PBMC受HBcAg刺激，释放IFN-γ的功能较强，提示患者的免疫系统处于活动期。HBcAg能明显刺激免疫清除期HBV患者PBMCs分泌IFN-γ，与免疫耐受期HBV患者PBMCs分泌IFN-γ相比差异有非常显著性(P＝2.55×10-7)；而HBsAg对免疫清除期、免疫耐受期二种患者PBMCs分泌IFN-γ没有明显差异(P＝0.11)；IFN-γ属于Th1淋巴细胞因子，主要调节细胞免疫反应。笔者的研究与国内外报道相符——对HBV携带者而言，HBcAg主要与细胞免疫反应有关，而HBsAg主要与体液免疫反应有关。笔者的研究还表明，与免疫耐受期HBV患者相比，免疫清除期HBV患者存在针对HBcAg的特异性细胞免疫反应。国内外许多研究已发现，免疫耐受期HBV患者体内的抗HBV特异性免疫反应之所以不能清除HBV，主要是由于缺乏特异性细胞免疫反应；临床上使用的治疗HBV药物——拉米夫定、IFN-α也主要针对的是血清转氨酶增高的免疫清除期HBV患者，而对于血清转氨酶正常的免疫耐受期HBV患者效果较差，这主要与以下原因有关：拉米夫定、IFN-α对HBV患者的治疗除了与其直接抑制HBV复制、抗HBV逆转录酶等作用外，还与HBV患者特异性免疫反应有关，免疫清除期HBV患者存在抗HBV特异性细胞免疫反应，能够与拉米夫定、IFN-α协同作用，清除残留的HBV［4～9］。
一般认为，HBV感染者血清中淋巴因子如IFN-γ、TNF、IL-2含量极低，用常规的ELISA方法检测不出来或不能显示不同HBV感染者血清淋巴因子含量的差异。笔者利用ELISPOT方法，检测HBV感染者PBMC体外受HBV特异抗原刺激后分泌的淋巴因子，不但敏感性较高，而且检测是HBV感染者PBMC受HBV特异抗原刺激后分泌淋巴因子的功能，ELISPOT反映的是机体免疫细胞受特异性抗原刺激后分泌淋巴因子的功能，不受体内众多因素的影响。国内外研究显示：（1）慢性、急性和重型肝炎患者血清中ＴＮＦ-α、IFN-γ、IL-4水平均明显高于对照组，并依次增高 ,还与血清丙氨酸氨基转移酶 (重症肝炎除外 )、总胆红素增高程度相一致，表明这些因子与乙肝患者肝细胞的免疫损伤密切相关，并随病情加重而明显升高 ；（2） 细胞因子在HBV携带者体内无明显改变甚至明显降低的事实，说明患者体内树突状细胞功能受抑制，ＴＮＦ-α、IFN-γ、IL-4分泌下降，该型患者机体对ＨＢＶ的免疫反应维持在较低水平上，既不能将病毒清除也不引起肝细胞的明显损伤；（3） 急性、慢性乙肝患者经过治疗后，各种细胞因子均出现明显下降，显示肝细胞损伤减轻以及肝脏功能恢复后对细胞因子的廓清作用增强；重型肝炎患者出现ＡＬＴ降低、ＴＢｉｌ升高之“胆酶分离”现象，是肝脏坏死的表现。此时，机体免疫处于严重失控状态而导致细胞因子异常增高且治疗后无明显下降。预后较好的急、慢性肝炎患者细胞因子水平明显低于预后不佳的重症肝炎患者，说明治疗后患者细胞因子水平升高或无明显下降，将提示病情危重或预后不良。测定乙肝患者血中细胞因子水平，对了解该病的免疫状态、肝脏损伤、预后及监测肝脏纤维化、癌变都具有重要意义。但具体到每一个患者血清淋巴因子浓度到底是由损伤的肝细胞还是由免疫细胞分泌的，还需进一步分析；而笔者用ELISAPOT方法检测PBMC分泌ＴＮＦ-α、IFN-γ、IL-4的功能，完全排除了损伤肝细胞引起的淋巴因子升高。
对HBV感染者的细胞免疫反应进行研究具有以下重要意义：(1)一般HBV感染者体内均存在特异性抗HBV抗体，但这种体液免疫反应却不能清除机体内的HBV，而那些HBV自限性感染者的抗HBV特异性细胞免疫反应明显强于HBV持续感染者，表明研究抗HBV特异性细胞免疫反应有助于预测HBV感染的预后。(2)目前临床上抗HBV治疗主要是干扰素(interferon, IFN)及拉米夫定(lamivudine)，这二种药物只使用于转氨酶二倍以上增高的免疫清除期HBV感染者，而国外研究发现干扰素及拉米夫定对转氨酶正常或轻度升高、而抗HBV特异性细胞免疫反应较强的HBV感染者也有效，建立抗HBV特异性细胞免疫反应检测指标就能扩大干扰素及拉米夫定治疗的适应证，指导临床用药。(3)干扰素及拉米夫定只能抑制体内HBV复制，而不能清除HBV，造成停药后HBV复发率较高，干扰素治疗，血清HBeAg/anti-HBeAg转阴率只有35%；拉米夫定治疗，HBeAg/anti-HBeAg血清长期转阴率、HBV DNA阴转率只有20%。国内外有学者提出免疫治疗方案，通过激发机体产生抗HBV特异性细胞免疫反应而清除体内的HBV，目前已知的清除HBV的细胞免疫反应主要有二种，抗HBV特异性的I类主要组织相容性复合物限制性的细胞毒T淋巴细胞免疫反应，通过破坏感染HBV的肝细胞而清除HBV。第二种途径是非融细胞性的细胞免疫反应，通过分泌抗HBV特异性淋巴细胞因子(肿瘤坏死因子，干扰素，白细胞因子)而在转录后阶段降低HBV感染肝细胞HBV转录水平［10,11］。
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作者单位： 1 423000 湖南郴州，郴州市第四人民医院
2 510515 广东广州，解放军第四五八医院传染病中心
(编辑：余 强)