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【摘要】 目的 考察平抑胶囊中姜黄素的最佳提取工艺。方法 通过正交试验，以姜黄素的含量和干膏收率为指标，考察醇浓度、加醇量、提取时间对提取效果的影响。结果 平抑胶囊中姜黄素的最佳提取工艺为用90%乙醇10倍加热回流提取2次，每次1.5h。结论 最佳工艺稳定，提取率高。
【关键词】 姜黄素；高效液相色谱；提取工艺；正交设计
Study on optimum preparation process of curcumin in Ganzhiping capsules by orthogonal design
PAN Hong-lin，YANG Min，XU Han-lin.Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan，430061，China
【Abstract】 Objective To optimize the preparation process of curcumin in Ganzhiping capsules.Methods The optimum preparation process was investigated by L9（34）orthogonal design as the curcumin and total mount of dry ointment content index. The chief factors influencing the extraction efficiency were as follows：the concertration of alcohol，times of added EtOH，the time of extraction.Results The optimum technical condition：added 10 times 90% EtOH，extracting 2 times and boiling 1.5h each time.Conclusion Curcumin content was high. The method is reliable，accurate and easy to operate.
【Key words】 curcumin；HPLC；extraction process；orthogonal design
平抑胶囊是由姜黄、白芍等组成的复方制剂，具有疏肝理气、活血化瘀、软坚散结、健脾渗湿的功效。方中君药姜黄为姜科姜黄属植物姜黄的干燥根茎，主要含挥发油和姜黄素类化合物，后者为二苯基庚烃类（苯环间二酮结构和烯酮的互变异构），有酚性和非酚性之分。姜黄素类主要有姜黄素（Curcumin）异名Turmericyellow diferuloylme- thane，分子式C21H20O6，分子量368.37，不溶于水及乙醚，溶于乙醇及冰醋酸。据报道［1］姜黄素有明显的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化的作用。白芍其主要有效成分为芍药苷，药理作用也很强，具有一定的代表性。《中国药典》2005年版一部［2］对姜黄素的含量规定不得少于1%，经含量测定符合药典标准。本文通过正交试验法确定其最佳提取工艺。
1 仪器、药材与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪，G1311A泵，G1316紫外检测器；色谱柱Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；Mettler十万分之一电子分析天平；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；超声波清洗器（华南超声设备厂）；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；姜黄素对照品均购自中国药品生物制品检定所；药材提取试剂用工业乙醇，其他试剂均为分析纯。白芍等购自武昌区药材公司，姜黄购自广西，经鉴定均为正品。
2 方法与结果
2.1 方法 对姜黄中姜黄素提取工艺影响较大的因素可能有：醇的浓度、加醇倍数、提取时间、药材粒度、提取次数等因素。预试验比较了药材粒度和提取次数2个因素的影响。分别取姜黄饮片或粗粉，每份75g，加10倍量90%乙醇，置1000ml圆底烧瓶中用可调温电热套加热回流提取，进行提取2次与3次的试验比较，每个样平行做3份，以干膏量和总干膏中姜黄素的含量为考察指标。从转移率大小及节约能源和时间、安全操作考虑，确定了选取姜黄饮片，提取2次。
正交设计时，选取了醇浓度、加醇倍数、提取时间3个因素，各设3个水平，其因素水平设置见表1。考虑各因素的交互作用，选用L9（34）进行正交试验。表1 姜黄醇提因素水平取姜黄饮片9份，每份50g，分别置1000ml圆底烧瓶内用可调温电热套加热回流提取，按表2中各实验号因素水平的要求进行处理，以干膏量和总干膏中姜黄素的含量为考察指标，试验结果见表2、表3、表4。表2 姜黄醇提正交试验安排及结果表3 干膏量的方差分析注：F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00 表4 姜黄素含量的方差分析注：F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00
2.2 色谱条件 色谱柱：Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（9.6%冰醋酸）（45:55）；流速：1.4ml/min；检测波长：420nm；柱温：35℃；灵敏度：0.08AUFS。
2.3 测试溶液的制备 对照品溶液的配制：精密称取经P2O5减压干燥器中干燥36h的姜黄素对照品6.0mg于25ml棕色容量瓶内，加甲醇20ml，超声处理20min使溶解，放至室温后加甲醇定容至刻度。
供试品溶液的制备：取平抑胶囊适量，倾出内容物，研细，精密称取0.2060g置具塞锥形瓶中，精密加入25ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理20min，放至室温，用甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤。精密吸取续滤液5～25ml 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
2.4 标准曲线的制备 用移液管分别吸取已配好的对照品溶液2、4、6、8、10ml置25ml棕色容量瓶内甲醇定容至刻度，用微量进样器分别取10μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积，根据进样量和测得的峰面积计算标准曲线。经计算得回归方程：Y=7277X－113（r=0.99996，n=5）。这一结果显示姜黄素的进样量与峰面积在0.192～0.960μg范围内具有良好的线性关系。
2.5 稳定性试验 吸取平抑供试品溶液，用20μl定量环间隔一定时间（2h）进样，连续测定5次。试验结果表明，姜黄素在8h内基本稳定，记录各峰面积，RSD=2.64%。
2.6 精密度试验 用20μl定量环进姜黄素对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样5次，测定峰面积并计算其相对标准偏差，RSD=0.74%，结果表明精密度较好。
2.7 回收率试验 采用加样回收法，取适量样品，加入姜黄素适量，按上述色谱条件测定，计算回收率。平均回收率为99.05%，RSD=2.73%。结果表明，本方法具有良好的回收率。
2.8 结果统计与分析 结果统计见表2、表3、表4。从方差分析表和正交试验结果可以看到，三因素中，对干膏量的影响大小依次为C > A > B，且C3 > C2 > C1；A1 > A2 > A3；B3 > B2> B1，其中A、B、C三因素对干膏量都有显著影响。三因素对干膏中姜黄素总量的影响大小依次为A >C > B，且A3 > A2 > A1；C3 > C2> C1；B1 > B2> B3，其中仅A因素对姜黄素含量有显著影响。C因素可确定水平为C3；对于B因素，在给定的水平条件下，虽无显著影响，但从有效成分尽量提取充分的角度考虑，拟选定B因素的水平为B3；为了使有效成分姜黄素能够提取完全，选定A因素的水平为A3。因此，从实际出发，综合考虑各因素，选择的最佳提取工艺为A3B3C3。即90%EtOH、10倍、每次1.5h。
2.9 验证试验 按最佳工艺验证4批，所得药液同前法处理，测定，取4批的平均值，得干膏量3.8633g，姜黄素总量为0.8943g，有效成分的转移率为78.10%。其干膏收率、干浸膏中姜黄素的含量基本稳定，说明工艺较稳定。
为了考察正交设计的严密性，将药渣再行提取一次，第3次的转移率为1.74%。结果可知，按最佳工艺提取姜黄4份，其干膏量、干膏中姜黄素的总含量基本稳定，多提1次对其结果影响不大，说明工艺较稳定。
3 讨论
3.1 提取次数、药材粒度的选择 预试验进行了饮片药材与粗粉、提取2次与提取3次的比较，结果表明饮片药材提取2次较为理想。分析因粉末吸附部分药液和有效成分，加上圆底烧瓶底部温度过高，姜黄素对热不稳定，导致粉末提取时烧瓶底部有糊化现象，使姜黄素含量偏低。
3.2 检测波长的选择 对姜黄素对照品溶液进行紫外-可见波段（200～700nm）的扫描，结果在420nm和261nm波长处有最大吸收。比较相同色谱条件下的分别于420nm和261nm波长下的色谱图，检测波长为420nm时的色谱图具有灵敏度高，分离度好，杂质干扰少的优点。因此采用420nm为检测波长。
3.3 流动相的选择 采用ZORBAX SB-C18柱，依据文献报道采用多种色谱条件测定［3，4］，峰形均不理想，后经过多次试验摸索，选用乙腈-水（9.6%冰醋酸）（45:55）为流动相，姜黄素类的分离效果最好（见图1、2）。
【参考文献】
1 Mou TH，You RL，Wei M，et al.Inhibitory effect of dietary curcumin on forestomach，duodenal and colon carcinodenesis in mice.Cancer Res，1994，54:5841.
2 国家药典委员会.中华人民共和国药典，一部.北京：化学工业出版社，2005，186.
3 张爱华，吴德康，叶冠.金熊胆安胶囊中姜黄素的含量测定.南京中医药大学学报（自然科学版），2001，17（6）:361-263.
4 夏文娟，肖小河，刘峰群，等.国产姜黄属植物的化学成分分析.中国中药杂志，1999，24（7）:423.
作者单位： 1 430061 湖北武汉，湖北中医学院药学院检定教研室
2 226001 江苏南通，南通大学基础医学院药学教研室
（编辑： 邓 锋）