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【摘要】 目的 观察和研究在椎间盘表面或周围和硬膜外间隙注射胶原酶能否扩散或渗透至椎间盘内。方法 (1)将实验动物的椎板咬除，暴露硬膜和椎间盘，先用铁制兽用注射器于L1-2椎间盘一侧加压注入0.9%生理盐水2～3ml;再用尖刀在L1-2椎间盘另一侧的纤维环上做十字切开造成髓核突出。注射用胶原酶1200u，溶于0.9%生理盐水2ml，在直视下将胶原酶溶液注射于硬膜外隙和椎间盘表面切开处各1ml;分别于不同的时间段处死实验动物，取标本进行组织学观察和组织化学检测。对照组造模方法同上，但不注射胶原酶。（２）将腰椎间盘突出症术中切取的标本和化学溶解术失败后行手术治疗时所切取的标本，进行组织学观察和组织化学检测。结果 实验动物组组织学观察见:纤维环外层胶原纤维呈不规则断裂、染色不均匀；纤维环中层和内层胶原纤维结构正常、排列规则，染色均匀;对照组则无上述变化。组织化学检测:将实验动物组、对照组、手术组和化学溶解术失败再手术组标本的纤维环内层、中层和外层分别匀浆、离心，取上清液，按Blanckaert法测定胶原酶，所得数据经统计学处理差异无显著性。结论 在硬膜外间隙和椎间盘表面注射胶原酶不能通过扩散和渗透的途径进入椎间盘内。针抵患处、酶达底物，是构成化学溶解术这一技术的基本要素，任何穿刺途径的确立和注射方法的选择，均应遵循这一基本原则。
【关键词】 胶原酶；渗透；化学溶解术；腰椎间盘突出症
Primary research on collagenase’s diffusion and permeation problem
JIN Xing，YANG Chun-sheng，WANG Yu，et al.Shenyang Orthopaedic Hospital，Shenyang 110044，China
【Abstract】 Objective Observing and research whether collagenase injected on surface or surround lumbar intervertebral disc and epidural space can diffuse or permeate into vertebra disc. Methods (1)Remove experimental animal’s lamina.discbase dura mater spinalis and vertebra disc.Make a cross incision on one side of L1～2 vertebra disc，s annuli fibrosi with a sharp scapel. Then injection with pressure 0.9％ saline on the other side of vertebra disc with syringe for animal to cause protrusion of nucleus pulposus，solute collagenase for injection 1200u to 0.9％ saline 2ml，drop 1ml collagenase solution on incision surface of epidural space and inter vertebra disc respectively，kill the experimental animals separately in different time，take samples to carry on histology observation and histochemical measurement，the method of control animal is the same above，but no injection collagenase. (2)Carry on histology observation and histochemical measurement on samples taken from operation of prolapse of lumbar intervertebral disc and operation after chemolysis failure.Results Experimental animal histology observation，the collagen fiber in outer irregulally layer of annular fibrous was irregulally disruptive. Dye was nonuniform，collagen fiber in the middle and inner layer was normal structure and arranged regularly，dye was uniform the control group has no changes of above. Histochemical measurement take the inner、middle、outer layer of the annuli fibrosi from the sample of experimental animals.Control animals、operative animals and reoperative. Animals after chemolysis failure to homogenate respectively，centrifugate and take the pure liquid，mcasure collagenase activity with Blanckaert method，the data handled with statistics did not show obvious difference. Conclusion Injection collagenase in epidural space and on the surface of intervertebra disc can not enter into the intervertebra disc though diffusion and permeation way.Needle to the site，enzyme to the substrate constitutes，the basic element of chemolysis，the establish of any penetration way and the choice of injection method，need to obey this basic principle.
【Key words】 collagenase; permeation; chemolysis; prolapse of lumbar intervertebral disc
1975年，朱克闻、董宏谋率先在国内应用胶原酶(collagenase)［EC3.4.24.3］化学溶解术治疗腰椎间盘突出症［1］。鉴于有些类型的突出，椎间盘的内容物已突出至椎间盘的后外侧，为了使溶解酶直接作用于突出物，他们设计了经与突出水平相一致的腰椎椎间孔穿刺、沿硬膜外的侧前间隙，将穿刺针送抵腰椎间盘的后外侧处，即:椎间盘的内容物突出超出椎体骨性边缘的部分，如图1所示的穿刺途径和注射方法。为了与盘内注射法相区别，特命名为盘外注射法［1］。其理论依据是:椎间盘是一个渗透系统，其软骨终板和纤维环具有半透膜的性质，盘外注射胶原酶可以通过扩散和渗透的途径进入椎间盘内［2］。由于多种原因，使人们对“盘外”法概念的理解上出现了差异，尤其是多学科参与后，将“盘外”法的概念不适当的扩大到经硬膜外后间隙、侧间隙和侧前间隙注射。而且，为弥补穿刺不到位和追求即时疗效，多与麻醉类药物和激素联用或混用。经过多年的临床实践，有诸多的学者观察到，经硬膜外途径行胶原酶化学溶解术的优良率与突出物的缩小率不呈正相关［3，4］。即:疗效的优良率与突出物的回缩率背离，尤其是在一些采用硬膜外注射法治疗失败的病例行手术治疗时发现，除适应证选择不当(如合并侧隐窝狭窄、黄韧带肥厚、椎体滑脱等)外，其突出物没有任何溶解甚至软化的迹象也是造成化学溶解术失败的重要原因。所以，有必要对硬膜外和盘外注射胶原酶后，其扩散和渗透的问题进行研究和探讨。
1 材料与方法
1.1 样本的制备
1.1.1 实验动物组 健康小尾寒羊30只，辽宁朝阳制药厂实验室提供，实验过程中死亡3只未补充。实验组14只，对照组13只，雌雄随机选择，8～12月，体重20～22kg。麻醉后于L1-2处切开，咬除棘突及椎板，显露硬膜和椎间盘，先用铁制兽用注射器于L1～2椎间盘一侧加压注入0.9%生理盐水2～3ml，再用尖刀在L1～2椎间盘另一侧的纤维环上做十字切开，造成髓核突出。注射用胶原酶1200u溶于0.9%生理盐水2ml，在直视下将胶原酶溶液注射于硬膜外隙和椎间盘表面切开处各1ml。对照组造模方法同上，但不注射胶原酶。分别于2h、4h、8h、12h、18h、24h处死实验动物，取L1～2脊柱段，去除软组织，沿上、下软骨板切下椎间盘，分别切取纤维环的内层、中层和外层，液氮速冻后保存待用。
1.1.2 突出椎间盘样本组 共22例，男性13例，女性9例，年龄28～52岁。其中入院后直接行手术治疗(以下简称手术组)12例;化学溶解术失败后再手术(以下简称再手术组)10例。术中切取样本:L3～4椎间盘2样本，L4～5椎间盘15样本，L5～S1椎间盘5样本，同法保存。3组均采用Blanckaert法［5］提取胶原酶。
1.2 胶原酶的提取和测定
1.2.1 提取液的制备 提取液Ⅰ:10mmol/L 二甲胂酸盐缓冲液(pH6)，其中含0.15mol/Ｌ NaCl，0.15mol/Ｌ X－Triton100，10.6mol/L ZnCl2，20mmol/L CaCl2和15mmol/L NaN3。提取液Ⅱ:10mmol/L二甲砷酸盐缓冲液(pH5)，其中除NaCl改用0.3mol/L外，其他与提取液Ⅰ相同。
1.2.2 胶原酶提取 将标本由液氮中取出，切成5mm3左右碎块，称取30mg置于试管中，加入20ml提取液Ⅰ提取，4℃柔和振荡24h。上清液存于4℃为胶原酶液Ⅰ。沉淀再加入20ml提取液Ⅱ，60℃4min，置于冷水中冷却，上清液存于4℃为胶原酶液Ⅱ。沉淀按后一过程重复1次，获取上清液为胶原酶Ⅲ。将上述3个胶原酶液混合，即为待测的样品胶原酶一。
1.2.3 胶原酶测定 溶液的配置:Ⅰ型胶原(Sigma公司)，用0.5ｖ/ｖ醋酸配成20mg/ml浓度，用缓冲液（100mmol Tris-HCl，200mmol NaCl，0.04%ｗ/ｖ NaN3，pH7.8)稀释至0.8mg/ml和0.7mg/ml。
1.2.4 标准曲线制作 取0.8mg/ml胶原1.0ml共8份，分别加入50mmol/Ｌ Tris-HCl缓冲液(含100mmolNaCl，10mmolCaCl2，0.02%ｗ/ｖNaN3，pH7.5) 0、0.143、0.333、0.6、1.0、1.667、3.7ml稀释至浓度为：40μg/50μl、35μg/50μl、30μg/50μl、25μg/50μl、20μg/50μl、15μg/50μl、10μg/50μl、5μg/50μl，取上述梯度浓度胶原各50μl滴入96孔组织培养板中，一式3份。30℃水浴16h后，30℃恒温箱中24h。用双蒸馏水沿孔边冲洗3次。每孔加入染色液10μl(25%ｗ/ｖ考马斯亮蓝，10%ｖ/ｖ醋酸，50%ｖ/ｖ甲醇)，25℃孵化25min。双蒸馏水冲洗3次，干燥后用酶联免疫检测仪(华光电子管厂)测定吸光度(600nm)。胶原量与吸光度的平均值分别为:35/0.39，30/0.33，25/0.25，20/0.19，15/0.13，10/0.09，
5/0.06，依此绘制标准曲线，见图2。
图2 胶原量与吸光度标准曲线
1.2.5 胶原酶消化板的制备 0.7mg/ml胶原各50μl滴入96孔板中。30℃水浴16h后，放30℃恒温箱中24h，用双蒸馏水沿孔边缘冲洗3次。
1.2.6 胶原酶的消化、测定 将胶原酶液用0.1mol/Ｌ(最终浓度)Tris-HCl、pH7.5缓冲液中和，每ml加胰蛋白酶100μl孵化25℃ 10min;然后加入大豆胰蛋白酶抑制剂，取100μl加入胶原酶消化板中。对照:缓冲液、胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂加入胶原酶消化板作为对照。37℃消化18h。冲洗，染色，测吸光度。胶原酶的活性用u/mg湿重软骨表示，活性单位定义为:100μl胶原酶液 37℃ 18h消化1μg胶原所需的胶原酶量。
1.3 组织学检查 将实验组、对照组以及手术组和再手术组术中切取的标本，以10%甲醛固定，HE染色后在光镜下观察。
1.4 统计学处理 结果以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS软件处理实验数据，组间比较用One-Way ANOVA分析后，采用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
胶原酶活性的检测结果见表1、2、3、4。经统计学处理，动物实验组与对照组、手术组与再手术组，组内各样本间差异无显著性(P＞0.05);动物实验组与对照组、手术组与再手术组，其组间差异亦无显著性(P＞0.05)。组织学观察结果: 动物实验组和对照组纤维环外层胶原纤维呈不规则断裂、染色不均匀;纤维环中层和内层胶原纤维结构正常、排列规则，染色均匀;手术组和再手术组则无上述变化，详见图3、图4、图5、图6。表1 实验组样本胶原酶活性测定表2 对照组样本胶原酶活性测定表3 手术组样本胶原酶活性测定表4 再手术组样本胶原酶活性测定
3 讨论
任何物质在体内的过程只有两种方式，即:主动运转和被动扩散。由于椎间盘细胞对外源性胶原酶无主动运转的功能，所以注射用胶原酶作为外源性胶原酶，在体内的过程只能是被动扩散。
3.1 椎间盘的物质代谢途与胶原酶的扩散和渗透 椎间盘的物质代谢有两个途径，即:经软骨终板途径和经纤维环途径，其中经软骨终板途径为主要途径。据Nachemson［6］观察：椎体骨髓腔血窦与软骨终板间有直接接触，物质代谢是通过血窦-软骨面进行的。但这种结构只占整个软骨终板面积的7%～10%，并呈现其接触面积从中央到周边逐渐减小的特点。软骨终板中央部分的渗透率(葡萄糖、分子量200、37℃)约为2.16～3.6cm2/s，周边部分的渗透率为0.216～0.36cm2/s，仅仅是中央部份的1/10;一些大分子物质，如血清白蛋白的渗透率则更低，仅为7×10-4cm2/h左右。说明终板中央部位的通透性较强，而周边部位的通透性较弱。Urban［7］给狗注射四环素，取材后在荧光显微镜下也观察到了这一现象。所以，在盘外或硬膜外注射胶原酶，酶液是远离软骨终板的中央，即:渗透最强的部位的。
经纤维环的途径为次要途径。Brodin［8］在给兔注射荧光染料30s后处死取材观察，发现染料在椎间盘的分布主要集中在纤维环的外层，由外向内染色浓度逐渐下降，在纤维环与髓核的交界处，没有荧光染料分布;说明椎间盘的营养和物质代谢是通过分布于纤维环表面的血管进入纤维环外层的，范围极其有限，不能达及内层纤维环和髓核。本实验是在直视下将胶原酶溶液注射于椎间盘周围、纤维环表面的，然而实验组和对照组各样本间胶原酶量差异并无显著性，而且切片也未观察到组织结构有相应的改变。说明“针不抵患处、酶未达底物”而藉酶液的扩散和渗透的理论只是一种假设和推论。
3.2 椎间盘细胞外基质的有效孔径与胶原酶的扩散和渗透 椎间盘细胞外基质主要由水和紧密排列的胶原(collagen)以及蛋白聚糖(proteoglycan PG)构成。基质的有效孔径由蛋白多糖的浓度所决定，介于100～400nm之间［9］。注射用胶原酶制剂的酶蛋白分子量为80～85KD，酶制剂中还含有作为稳定剂的分子量为69KD的人血清白蛋白，其总分子量介于149～154KD之间。由于其分子量较大，无法通过椎间盘基质100～400nm的微孔进入椎间盘。组织化学检测结果也证实了这一点。
3.3 椎间盘的物质转运机制与胶原酶的扩散和渗透 椎间盘的物质转运是由溶质浓度梯度所造成的分子被动扩散，和压力差所产生的溶液对流这两个机制所决定的。溶质的分子量、形状、所带电荷等因素决定其扩散能力的大小［10］。作为扩散介质的椎间盘细胞外基质，由于含有大量的糖胺多糖而呈负电性。电中性的小分子溶质，如O2、葡萄糖等可以在椎间盘基质中自由扩散［11］。而带有负电荷的溶质，由于椎间盘细胞外基质中有硫酸化的糖胺
多糖存在使蛋白聚糖带有负电荷，带正电荷的物质如小的阳离子可被吸附，而带负电荷的物质则被排斥［12］。众所周知，蛋白质是两性电解质。其等电点若与溶液的pH相等，则为电中性;若溶液的pH值高于蛋白质的等电点、则蛋白质带负电;反之则带正电13］。注射用胶原酶的等电点pH为5，在体液pH值近于中性的环境下，注射用胶原酶是带负电的。由于椎间盘细胞外基质电荷性质的作用，带有负电的注射用胶原酶是被排斥的。
胶原酶属水解酶类、金属蛋白酶组，是一个双成分酶。其酶的结构中有维持其活性所必需的2价阳离子，如Zn2+或Ca2+。有学者据此推论［2］:因为胶原酶中含有2价的阳离子，所以椎间盘基质的负电性可以将胶原酶吸附至椎间盘内。需要特别指出的是:金属蛋白酶结构中维持其活性所必需的离子不是以游离态存在的，而是与酶蛋白结合在一起的，故其电荷性质与酶蛋白是一致的［13］。所以，在讨论和分析双成分酶的电荷性质时，应该将其视为一个整体，不能分而论之。
3.4 椎间盘的对流与胶原酶的扩散和渗透 椎间盘内、外的水压差是物质对流的基础。Holm［14］等人通过给犬注射同位素后，观察运动组和麻醉组动物椎间盘内放射性同位素的分布和结合情况，对椎间盘的对流方式进行了研究。结果显示:椎间盘的物质代谢主要依靠扩散，对流所起的作用很小。在日常生理活动中，如:人步行时椎间盘的液体交换量仅为其液体总量的0.11‰［15］。所以，对流形式对椎间盘物质代谢的作用甚微。
3.5 体位引流与胶原酶的扩散和渗透 盘外或硬膜外注射胶原酶后依靠体位引流，以期达到扩散和渗透的目的是目前临床上常用的做法。本研究是在实验动物椎间盘的背侧及硬膜外的侧间隙注射胶原酶的，按照体位引流“学说”酶液应该向腹侧流动，通过扩散或渗透进入椎间盘内。然而，实验结果并不支持这一做法。而且已有研究结果［16］表明:在人类，每天有2/3的时间(约16h)椎间盘内的液体是向外流动的，晨起时身高与黄昏时身高的差异就是例证。
综上所述，椎间盘是机体最大的无血供组织，其营养和物质代谢完全依靠经软骨终板和
纤维环的扩散与渗透。但是，椎间盘只是一个离子和液体以及一些小分子物质交换的渗透系统，而并非是所有物质都可以进行扩散和交换的渗透系统。其软骨终板和纤维环虽然具有半透膜性质，但是由椎间盘的理化性质所决定(液静压、水合程度、固定电荷密度、固有电荷性质、蛋白多糖密度、胶原/蛋白多糖比例、基质孔径大小、软骨终板退变程度、纤维环完整与否、不同物质的输运系数和分布系数等)，一些离子、小分子物质可以通过扩散或渗透的途径进入椎间盘;而大分子物质，如酶蛋白、血清白蛋白包括注射用胶原酶等，以及一些带有负电荷的抗生素是被排斥的。
化学溶解术治疗腰椎间盘突出症，是利用水解酶类对底物的特异性水解作用(木瓜酶→蛋白聚糖、胶原酶→胶原)来达到治疗之目的。所以，“针抵患处、酶达底物”是构成化学溶解术这一实用微创技术的基本要素和终极目的，这是酶学理论中最基本的问题，也是化学溶解的核心问题。因此，任何穿刺途径的确立和注射方法的选择都不应该与之相悖！由于在盘
外、硬膜外注射胶原酶，不能通过扩散和渗透的途径进入椎间盘内，所以由此而获得的临床疗效究竟是注射用胶原酶对一些炎性介质的抑制作用、抑或是其他因素所致，应该进行更深入地研究和探讨。
(本文图片见附页1)
(致谢：谨向辽宁朝阳制药厂解文秋工程师、辽宁中医药大学基础部王玉惠教授、沈阳医学院刘克茂副教授和病理教研室王旭光博士以及本院翟良全、宋今词、王伟、王欣等诸位医师的支持与协作致以诚挚的谢意。)
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作者单位： 110044 辽宁沈阳，沈阳市骨科医院
(编辑：石 岚)