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【摘要】 二恶英具有致癌、致畸作用以及心血管神经内分泌毒性，近几年研究发现二恶英的胎盘毒性是其导致宫内死亡的重要原因。TCDD是二恶英类化合物中毒性最强的一种。TCDD对斑马鱼胚胎发育毒性有了较全面和深入的认识，对阐明TCDD对人类胚胎发育毒性有重要意义。
【关键词】 2，3，7，8-四氯二苯并对二恶英（TCDD）；斑马鱼；胚胎发育毒性
自我国加入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》，简称《POPs公约》，人们对环境持久性污染物（POPs）的认识不断加强，有关二恶英（Dioxin）的研究也受到重视。除皮肤毒性、生殖毒性、免疫毒性、致癌性之外，二恶英的胎盘毒性尤为引人注目［1］。其中，2,3,7,8－四氯二苯并对二恶英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，简称TCDD）毒性最强，同时也是研究最彻底的，因此常常用TCDD这个称呼来代替二恶英类化合物。TCDD对猴、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、鸡的毒性研究较多，鱼类也是TCDD的敏感生物之一，特别是在胚胎期［2］。
斑马鱼（Danio rerio）是属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼。1981年，Streisinger等报道了斑马鱼的体外受精及单倍体诱导技术，建立了纯合品系，并介绍了斑马鱼的第一个自然突变体-golden，至今已证明斑马鱼是适合用于饱和诱变的唯一的脊椎动物。目前斑马鱼、人、小鼠是生命科学研究中三种主要的模式脊椎动物。
1 斑马鱼作为胚胎发育毒性研究模式生物的优势
首先，斑马鱼是脊椎动物，心血管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多共同特点。斑马鱼的基因组中含有约30000个基因，这个数目与人差不多，而且它的许多基因与人体存在相应关系。
其次，斑马鱼还具以下独特优势：成年鱼个体小，易于饲养；常年产卵，成熟的雌鱼每隔1周可产几百枚卵；卵在体外受精、发育，对母体无任何影响；从受精卵发育到完整的胚胎形成只需24h。又由于胚胎完全透明，可视性好，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞，荧光染色或使用其他标记物可使细胞系观察得更清楚［3］。研究者不仅能跟踪观察每个细胞的发育命运，也可观察到原肠期的细胞运动、脑区形成和心跳等胚胎发育情况［4］，同时发育异常的突变体也很容易被鉴别出来［5］。现对于斑马鱼的研究已经成功地发展了突变技术，建立了斑马鱼遗传图谱，分析了有价值的突变体，成功地发展了转基因斑马鱼技术，这些都成为毒理学研究的优良资源。
另外，斑马鱼的胎心类似于人胚胎的心脏，分为心房和心室，房室之间有瓣膜。斑马鱼特别适合于心血管系统的研究，因为在活的鱼卵中，心脏明显的形态和功能缺陷能用肉眼直接观察到，较细微的差别可通过分子标记物来识别。而且斑马鱼仔鱼早期生存不依赖于血液循环［6］，这为观察心血管系统异常发育的发展过程提供了一个极好的模型。
2 TCDD对斑马鱼的胚胎毒性
2.1 致死性 董武、魏强等报道24hpf （受精后24h）染毒至180hpf，摄食对照群，0.1μg/L，0.3μg/L，0.5μg/L，1μg/L，10μg/L染毒群的死亡率分别是0，0，5%，60.2%，61.8%，100%。10μg/L染毒群在144 hpf 已全部死亡［7］。这种试验条件下180 hpf的LC50约为0.3～0.5μg/L。Henry等测定240hpf的LC50为2.5ng TCDD/g egg［8］。
使用6ng/ml TCDD（4hpf）染毒，144hpf开始出现死亡，240hpf 全部死亡，虽然推迟至96hpf染毒能避免心血管缺陷的出现，但并不能避免致死现象［9］。可见，TCDD引起的致死性不依赖于心血管毒性。
2.2 下颌发育短小 斑马鱼下颌发育短小已成为TCDD引起的典型毒性之一［10～14］。24hpf开始对斑马鱼胚胎持续静态染毒至观察结束，1ppb染毒群在60hpf引发下颌生长的显著（P<0.05）抑制，且作用强度与TCDD浓度正相关的［10］。对下颌与身长的比值进行研究，证明TCDD的对下颌的抑制作用是特异的，不是继发于对胚胎发育的抑制。软骨染色观察显示TCDD能显著抑制头部软骨的生长，特别是Meckel’s 软骨，但并不影响软骨的形成。为了确定TCDD对胚胎的作用时间，分别在0，12，24，36，48，60，72，84hpf开始染毒，96hpf观察对下颌发育的影响。0～24hpf染毒对下颌抑制的程度无明显区别，随后24～84hpf染毒对下颌的抑制作用逐渐降低。可见于24hpf完成的神经嵴细胞的分化过程［15］不是TCDD产生下颌短小毒性的关键时期（critical period）。
尽管躯干血液循环显著降低，但直到下颌生长晚期下颌血液循环才受到影响。60hpf 鳃下动脉是下颌原始基的主要灌注血管。72hpf TCDD（0.3,0.5,1ppb）显著增加鳃下动脉分支的红细胞灌注率，至96hfp两高剂量组（0.5,1ppb）才出现对红细胞灌注率的显著抑制。最初红细胞灌注率显著增加可能是下颌生长或其他循环中断的代偿反应。这些结果表明局部循环障碍和下颌发育迟缓是分离的，至少在60～72hpf期间是分离的。下颌短小可能是TCDD对下颌原始基的直接作用，而严重的循环障碍在后期可能会进一步加重损伤。
2.3 神经系统 Adrian等发现TCDD（2hpf）染毒可减小胚胎脑容量，且相同身长的鱼，脑容量的减小程度随TCDD浓度增加而加剧。各组内胚胎脑容量与身体大小线性相关（r2 values：丙酮对照组＝0.7014, 100ppt 染毒组＝0.6336, 120ppt 染毒组＝0.6364）。测定神经元密度后与脑容量相乘，进而分析神经元总量的变化。100，120ppt染毒组168hpf表现出神经元显著的缺失。眼部杆锥层和脑部（松果体，midbrain-hindbrain boundary，端脑，间脑）的解剖学检查表明TCDD染毒对神经系统的结构发育没有影响［16］。
染毒的仔鱼脑神经元容量变小，使学习和行为能力下降，易发生早期残疾，因此导致它们易被捕食。再加上TCDD具生物蓄积性，在受到TCDD污染的环境中，神经学缺陷在食物链的越高级的动物中会越明显。
2.4 循环系统
2.4.1 总主静脉（Common Cardinal Vein） CCV是左右两侧连接前、后主静脉和心脏的一对血管，在发育的第1周将所有静脉血液送回心脏。它也是60hpf前通过卵黄囊的唯一血管。CCV在发育的过程中出现广泛的重塑（remodel）过程［17］。
使用血管内皮细胞特异表达GFP的Fli1-eGFP转基因斑马鱼用来观察CCV的发育情况，斑马鱼胚胎受精后TCDD（10ng/ml）染毒1h对总主静脉的发育产生显著影响［18］。对照组，约24hpf CCV的血管内皮细胞出现，48～74hpf 发生CCV由片状血管内皮细胞到管状的重塑过程，74hpf总主静脉建立和心脏静脉窦的联系，几乎同时由于心脏向背侧的移行，总主静脉失去和心包脏层的联系，开始退化。染毒组44hpf首次检测到对CCV生长的显著抑制，62hpf CCV区域减小到对照组的63%，随后由于对照组在重塑过程中CCV区域亦显著减小，对照组和染毒组的区别不再明显。80hpf，染毒组CCV的长度明显长于对照组，CCV退化被抑制。98 hpf，GFP在鳃弓神经嵴原性细胞（neural-crest-derived cells）的表达阻碍了对总主静脉发育的进一步的观察。
测定0.1～10ng TCDD/ml CCV区域减小（56hpf），心包水肿（72hpf），身长减少（72hpf）的剂量反应曲线，比较它们对TCDD的灵敏性。结果表明CCV区域减小（0.5, 1, 2.5, 5, 10ng TCDD/ml）比心包水肿（2.5, 5, 10ng TCDD/ml）灵敏5倍，比身长减小（5,10ng TCDD/ml）灵敏10倍。
2.4.2 心脏 受精后斑马鱼胚胎静态染毒TCDD 1h，显示出对心脏的一系列毒性：48hpf心肌细胞的数量的减少，随后出现心脏成环（altered looping）和形态学改变，72hpf心脏容量全面缩小。这些变化伴随着心脏功能的损伤，120hpf血液倒流和心输出量减少多发，最终出现心室停顿［19］。
最为重要的发现是在48hpf，即在外周血流量发生变化的前一天，心肌细胞数量的减少。Mably等也通过细胞计数证明TCDD通过抑制心肌细胞增长，促进心脏细胞死亡使心脏变小［20］。此时，心脏结构和血液流动均没有显著变化［7，9］。可见，心脏是TCDD的直接靶点，对心脏的作用并非继发于循环障碍。
72hpf心脏形态侧面观察可见：对照组心房与心室并排排列，大面积重叠；TCDD染毒组心房心室线性排列，心室紧缩，心房狭长。TCDD造成的心脏变长，可能因为心脏和总主静脉的连接点未能成功向背侧移行，因此机械地延长了心脏。但心脏形态学的改变在背侧移行之前发生，不可能继发于CCV退行，但不能确定在后期，CCV后侧移行的抑制是否对心脏形态的延长起作用。同理，心包水肿也可能使流入流出血管与心脏的连接点（the inflow and outflow attachment points）距离增大，引起心脏形态的延长。
最早的血液倒流发生在72hpf，此时血流还很充足，心脏收缩性也未见变化。晚期，随着心输出量和血流量的减少，在大多数胚胎中可以观察到血细胞在心房和心室，心室和心室流出通道间往复运动。血液倒流的发生机制可能是瓣膜功能缺陷或后负荷增加阻碍了循环。
假设心室停顿是由心脏压塞（cardiac tamponade）机制引起，即心包压力增大抑制心脏充盈，从而抑制了心跳。那么对心房和心室应产生同样的作用。但事实上，TCDD染毒组心房可见缓慢蠕动状收缩［19］。另外，改变环境渗透压抑制水肿症状后仍可观察到心室停顿，可见它们不是继发于心包水肿［10］。心室停顿机制可能是房室交界处动作电位传导失败或虽然心室存在动作电位但收缩被其他因素阻断。
2.4.3 红细胞生成 Cassandrad. Belair报道 6ng/ml （4hpf）TCDD 染毒，60hpf 引起发育斑马鱼循环红细胞轻微减少，致96hpf急剧减少，在此过程中没有明显的出血现象。同时发现TCDD能阻断红细胞生成过程中从原始造血（primitive erythropoiesis）到定向造血（definitive erythropoiesis）的转化，但不影响已成功转化的细胞生存。4～72 hpf TCDD 6ng/ml 染毒，均可致循环红细胞减少，但96hpf 染毒不再引起这样的作用。这说明TCDD干扰的红细胞发育过程在96hpf完成［9］。
2.4.4 血液循环 受精后立即接触TCDD的斑马鱼胚胎全胚循环（overall circulation）48hpf出现［7，9］，接下来的两天血流速度下降，直到96hpf血流停止［7～9］，伴随多血管红细胞灌注率的减少［6，8，21］。
董武、魏强报道，0.3μg/L，0.5μg/L，1μg/L 染毒群从60h 开始血流的停滞有随时间推移增加的趋势，至120hpf，血流停滞率分别为10%、60%和100%［7］。但TCDD 6ng/ml（96hpf）染毒不再引起这样的作用。这说明TCDD干扰的心血管发育过程在96hpf完成。虽然TCDD对血流有影响，却未观察到48, 60, 72, 96hpf TCDD染毒对血管结构造成影响［9］。
Hiroki Teraoka等对特定血管的红细胞时间推移计数，实现局部循环的定量评价。在剂量大于等于0.3ppb组，72hpf节间动脉红细胞灌注率显著减少。虽然TCDD显著抑制躯干节间动脉的红细胞灌注率，但对头部血管只产生轻微抑制（如视血管）。其他躯干血管（如背主动脉和后主静脉）红细胞灌注率的减少情况类似于节间动脉。不同血管红细胞灌注的减少量不同，原因不清，可能是TCDD对不同血管的上皮细胞作用不同。96hpf，TCDD染毒的胚胎所有血管的红细胞灌注率均被抑制，这可能和心输出量的减少有关［10］。
2.4.5 中脑循环 研究表明TCDD染毒减少胚胎中脑唯一的灌注血管-中脑血管的血流量［22］。对照组中脑血流的最高值在50hpf出现，后缓慢降低至60hpf血流稳定，持续到120hpf。TCDD染毒组50hpf，血流抑制程度达到极点（0.3, 0.5, 1.0ppb）。由于对照组血流的缓慢下降60hpf时染毒组血流情况短暂恢复至对照水平。随后又发生显著抑制，0.5,1.0ppb组在96hpf时血流几乎停滞。躯干和其他头部血管的血流在72hpf前都未发生变化。与节间动脉、视网膜中央动脉、视血管（optic vein）、腮下动脉的血流减少相比，TCDD引起的中脑血流量的减少提前10h发生［10］，说明这是TCDD对心血管系统最早的副作用。因此背侧中脑循环在50hpf的减少不可能是继发于较晚发生的贫血，也不可能是继发于心脏的功能障碍引发的局部缺血，可能是TCDD对中脑血管发育和功能的直接作用。
2.4.6 水肿 董武、魏强 （2002）报道，0.3 ～ 10μg/L浓度的TCDD 染毒时，染毒群观察到心脏、卵黄囊、眼球周围和胴体等部位的水肿。最早观察到的水肿是心脏周围水肿，其次是卵黄囊水肿，再其次是眼球周围，最后是胴体水肿［7］。使用甘露醇减少斑马鱼的体内外渗透压梯度，可明显的减轻心包和卵黄囊的水肿，可见TCDD染毒会引起斑马鱼环境水进入屏障（a barrier to incoming water）的衰竭，但甘露醇只能部分恢复已发生的水肿，提示TCDD可能损伤水排泄功能，使水肿液在体内蓄积［23］。
3 展望
已有的研究已经较广泛地研究了TCDD对斑马鱼胚胎的毒作用终点。研究过程中的很多假设还有待进一步的验证。例如，全身毒性与特定靶器官毒性之间的原发继发关系；毒性与染毒时间、染毒剂量之间的关系等等还需要进一步的研究。
工业的发展使水源污染问题日趋加重，严重威胁着人们的健康。对水域污染进行监测及全面了解水污染情况是解决水源污染的首要前提。随着转基因技术的发展，已有实验室通过针对不同污染物作用的不同启动子，用以启动表达荧光蛋白的基因，培育出一些在特定条件下显示绿色或红色荧光的转基因斑马鱼，对污染物进行直观的监测。随着研究的深入，发现斑马鱼胚胎对TCDD最为敏感毒性终点，进而应用分子生物学技术实现对环境TCDD含量的监测，更具现实意义。
随着对斑马鱼认识的深入和相关分子生物学技术的飞速发展，斑马鱼在此领域会有更广阔的发展空间。
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作者单位：100050 北京，中国医学科学院药物研究所安全性评价中心