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【摘要】 目的 分析癌前病变、癌旁组织、宫颈癌中的凋亡抑制基因蛋白Survivin与抑癌基因蛋白PTEN表达阳性率及相关性，探讨Survivin和PTEN在宫颈癌发生、发展中的作用。方法 采用免疫组化S-P法测定135例慢性宫颈炎、宫颈糜烂伴鳞化（慢鳞20例）、宫颈上皮内瘤变（CIN 31例）、癌旁组织（42例）、宫颈癌（42例）的Survivin和PTEN蛋白表达阳性率，以10例正常宫颈组织作为对照。结果 （1）宫颈癌与慢鳞、癌旁组织中，Survivin的表达明显增强（P<0.05）;而PTEN的表达明显减弱（P<0.05）；（2）Survivin的表达与宫颈癌组织学分级、浸润深度、临床分期有关（P<0.05）;而与不同年龄无关（P>0.05）；PTEN蛋白的表达与宫颈癌浸润深度、临床分期有关（P<0.05），而与不同年龄、组织学分级无关（P>0.05）；（3）Survivin和PTEN蛋白在癌旁不典型增生与慢鳞的表达阳性率差异均有显著性（P<0.05）；与CIN相比差异无显著性（P>0.05）；（4） Survivin与PTEN蛋白的表达在CIN、癌旁组织、宫颈鳞状细胞癌中的表达呈显著负相关（P<0.05）,而且在宫颈癌中的表达相关性更为密切。结论 Survivin的异常高表达与PTEN的异常低表达参与了宫颈癌的发生、发展，与凋亡抑制和增殖能力增强有关，发生在宫颈癌恶性转化的早期，并且其表达程度可作为预后不良的标志。
【关键词】 宫颈鳞状细胞癌 癌旁组织 CIN Survivin PTEN 免疫组织化学
Analysis on the expression of Survivin & and PTEN protein in Precancerous precancerous lesions, adjacent mucosa and cervical carcinoma
ZHANG Pei-rong, HUANG Mei-zhu ,WANG Hong-yan,et al.Department of Pathology , Second Hospital of Mudanjiang City,Heilongjiang 157000，China
【Abstract】 Objective The purpose of this paper is to analyze the expression and the relationship of apoptosis inhibition factor Survivin and carcinoma-inhibiting protein PTEN in cervical cancer, adjacent mucosa and precancerous lesions and discuss the expression of Survivin and PTEN on the occurrence and development of cervical cancer.Methods using tThe immunoassay S-P method was used to determine detect the positive rate of Survivin and PTEN, . we choose 135 cases with of chronic cervicitis including 20 cases with of cervcali erosion of metaplasia （CCM20）, cervical intraepithelial neoplasia （CIN31）, cervical carcinoma （42）, adjacent mucosa （42）, with another and 10 cases of normal cervical specimens as the referencecontrol were selected.Results （1）To cervix cancer, cervical carcinoma and adjacent mucosa, the expression of CCM and, Survivin expression tends to increased （Wilcoxon test P<0.01）, while; the expression of PTEN tends to decreased （P<0.01）. （2）Survivin was related with the patients’ histological grade, infiltration depth, and clinical stages（P<0.05）, but not related with the patients’ ages of cervical cancer（P>0.05）;PTEN was related with the patients’ infiltration depth , and clinical stages（P<0.05）, but not related with the patients’ ages or histological grade of cervical cancer（P>0.05）.（3） The positive rate of Survivin and PTEN protein in dysplasia of cervical cancer adjacent mucosa and CCM has had remarkable meaning, but without statistics meaning as comparing comparied with CIN（P>0.05）.（4） The expression of Survivin and PTEN was extremely negatively correlated in CIN and, cervical cancer, and adjacent mucosa（P<0.01）and highly related in cervical carcinoma.Conclusion The abnormal high expression of Survivin and abnormal low expression of PTEN in cervical carcinoma may be involved in the occurrence and development of cervical carcinoma, which maybe also results in the cell apoptosis and proliferation. This phenomenon occurs in theearly period of cervical carcinoma transformation, higher levels of Survivin and lower levels of PTEN may can indicate prognosis for patients with cervical carcinomas.
【Key words】 cervical carcinomas,; adjacent mucosa; CIN; Survivin and; PTEN; immunohistochemistry
宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤，全世界每年约有45万～50万妇女患病，我国每年新增宫颈癌病人13.51万左右［1］，是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要疾病，尤其是年轻宫颈癌病人的发病率有上升趋势。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因，其独特的结构、特殊的组织分布和作用机制及明显的抗凋亡作用尤其引人注目。PTEN是迄今发现的第一个具有双特异性磷酸源性的抑癌基因，在维持细胞的增殖分裂和凋亡的平衡中起重要作用，与人类多种肿瘤的发生发展有关［2］。目前国内外PTEN在宫颈癌中的研究少见报道，且结果不一［3，4］。本研究着重探讨新的细胞凋亡基因Survivin及抑癌基因PTEN蛋白在宫颈鳞状细胞癌前病变、癌旁组织及癌组织中的表达及其两者的相关性分析。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选取2000年1月～2005年10月手术切除或活检的慢性宫颈炎、宫颈糜烂伴鳞化（简称慢鳞）20例，宫颈上皮内瘤变（CIN）标本31例，癌旁组织（鳞状上皮并除外癌细胞浸润）42例，宫颈鳞状细胞癌42例，其中组织学分级：高分化5例，中分化25例，低分化12例；临床分期：I期30例，II期以上12例。另选择10例正常宫颈组织作为对照，患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗，所有组织均经病理学诊断证实。其临床分期和组织学分级均按FIGO（1986年）和WHO分级标准。
1.2 主要试剂 兔抗人Survivin多克隆抗体（浓缩型）、鼠抗人PTEN单克隆抗体（即用型 28H6）、S-P免疫组化试剂盒（即用型）均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫组化 采用免疫组化S-P法，实验步骤按试剂盒说明书进行，以柠檬酸缓冲液高温高压进行抗原修复，DAB显色，同时用PBS代替一抗作染色阴性对照，用已知的PTEN染色阳性的乳腺癌组织片和已知的Survivin染色阳性的乳腺癌组织片分别作二者的阳性对照，Survivin和PTEN蛋白阳性均胞浆表达。
1.3.2 统计学方法 采用SPSS13.0软件对Survivin和PTEN在各组中表达的阳性率进行比较，采用χ2检验；等级资料样本在各组中表达强度的比较采用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法）、成组设计两样本比较秩和检验（Wilcoxon两样本比较法）、两样本间相关性分析用Logistic Regression检验，以α＝0.05为显著性检验水准。
1.4 判断标准 根据着色的强弱，不着色为0，轻度着色为1，中度着色为2，强着色为3；着色肿瘤细胞总数的百分比：无着色为0，< 25％为1，25％～50％为2，> 50％为3；两种积分相加，依照0为－，1～2为＋，3～4为＋＋，5～6为＋＋＋，进行半定量判断；>2（＋＋和＋＋＋）为阳性，< 2（－和＋）为阴性进行定性判断。
2 结果
2.1 发病年龄 慢鳞患者年龄25～52岁，中位数37.2岁；CIN 患者年龄27～59岁，中位数39.1岁；宫颈鳞状细胞癌患者年龄28～66岁，中位数45.4岁。
2.2 Survivin、PTEN在慢性宫颈炎、癌旁组织、宫颈鳞状细胞癌的表达
2.2.1 Survivin在慢性宫颈炎、癌旁组织、宫颈鳞状细胞癌中的表达 采用χ2检验，Survivin的阳性表达率慢鳞25%（5/20），CIN 64.5%（20/31），癌旁组织75%（24/42），宫颈鳞状细胞癌78.6%（33/42）呈逐渐增强趋势；10例正常宫颈组织中Survivin均无阳性表达。宫颈癌（见图2）的阳性表达率高于慢鳞组织（见图1）、癌旁组织（P<0.05），而与CIN的表达差异无显著性（P>0.05）；癌旁组织的阳性表达率明显高于慢鳞组织（P<0.01），而与CIN的表达差异无显著性（P>0.05）；在癌旁组织中鳞化的阳性表达率22.2％（4/18）低于不典型增生表达（P>0.05）见表1。
2.2.2 PTEN在慢性宫颈炎、癌旁组织、宫颈鳞状细胞癌中的表达 采用χ2检验，PTEN的阳性表达率慢鳞90.5%（19/20），CIN 45.2%（14/31），癌旁组织52.3%（22/42），宫颈鳞状细胞癌28.6%（12/42）呈逐渐降低趋势，正常宫颈组织中均阳性表达（均鳞状上皮表达，而腺上皮不表达）；宫颈癌（见图4）的阳性表达率低于慢鳞组织（见图3）、癌旁组织（P<0.05），而与CIN的表达差异无显著性（P>0.05）；癌旁组织的阳性表达率明显低于慢鳞组织（P<0.01），而与CIN的表达差异无显著性（P>0.05）；在癌旁组织中鳞化的阳性表达率22.2％（4/18）低于不典型增生表达（P>0.05），见表1。
2.3 Survivin、PTEN在宫颈鳞状细胞癌的临床病理特征中的表达
2.3.1 Survivin在宫颈鳞状细胞癌的临床病理特征中的表达 采用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis H法）、成组设计两样本比较秩和检验（Wilcoxon U两样本比较法），Survivin表达在宫颈癌组织学分级、浸润深度及临床分期之间差异具有显著性（H＝4.134、U＝90.0、U＝94.5，P<0.05），而在不同年龄中，Survivin表达差异无显著性（U＝136.5，P>0.05），见表1。
2.3.2 PTEN在宫颈鳞状细胞癌的临床病理特征中的表达 PTEN表达在浸润深度及临床分期之间差异有显著性（U＝123.0、U＝48.0，P<0.05），而在不同年龄及组织学分级中差异无显著性（U＝121.0、H＝1.242，P>0.05），见表1。 表1 各组织Survivin和PTEN蛋白表达情况
2.4 Survivin和PTEN在CIN、癌旁组织及宫颈鳞状细胞癌中的相关性分析
2.4.1 Survivin和PTEN在CIN中的相关性分析 采用Logistic Regression检验相关性分析，Survivin和PTEN的表达呈显著负相关（P<0.01，b1=-2.603），见表2。
2.4.2 Survivin和PTEN在癌旁组织中的相关性分析 采用Logistic Regression检验相关性分析，Survivin和PTEN的表达呈显著负相关（P<0.05，b2=-1.466），见表2。
2.4.3 Survivin和PTEN在宫颈癌中的相关性分析 采用Logistic Regression检验相关性分析，Survivin和PTEN的表达呈显著负相关（P<0.01，b3=-4.060），见表2。表2 Survivin和PTEN在CIN、癌旁组织、宫颈癌中的相关性分析
3 讨论
3.1 Survivin在慢性宫颈炎、癌旁组织及宫颈鳞状细胞癌中的表达 Survivin属于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosisprotein,IAP）家族新成员，是具有细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，是至今发现最强的凋亡抑制因子。Caspase级联式激活并溶解蛋白质是凋亡发生的核心机制。Survivin能抑制由Fas/caspase-8 和Bax /细胞色素C诱导的caspase活化和凋亡，可能通过作用于各个凋亡途径的汇集点，即直接抑制终末效应蛋白 caspase-3和 caspase-7，从而抑制凋亡［5］。
在胚胎及胎儿期，Survivin表达丰富，而在正常成人终末分化组织中，除了胎盘和胸腺微弱表达外，其他组织基本很难检测到Survivin的表达［6］。本实验正常对照宫颈组织的阳性表达率0（0/10），与Kim等［7］和Michael等［8］用免疫方法研究所得结果一致。但在慢鳞组织中的阳性表达率25％。本实验中检测Survivin的表达，其中宫颈癌的阳性表达率显著高于慢鳞组织、癌旁组织（P<0.05），与CIN的表达差异无显著性（P>0.05），与王梅等［9］研究结果类似；癌旁组织的Survivin阳性表达率显著高于在慢鳞组织的表达（P<0.01），与CIN的表达差异却无显著性（P>0.05），CIN、癌旁组织不典型增生的Survivin表达差异可能与其发生机制有关，从而提示Survivin的表达可能出现在宫颈癌恶性转化的早期，并可能具有促进这些损伤恶性转化的作用。同时本实验发现，从慢鳞→CIN→宫颈癌的演变中，Survivin的表达率是逐渐升高的，而且差异有非常显著性（P<0.01），这表明Survivin的再激活可能与宫颈癌的发生、发展密切相关。在Survivin表达与宫颈癌临床病理特征的关系研究中，本实验结果显示，Survivin的表达与宫颈癌的组织学分级、浸润深度、临床分期显著相关（P<0.05），但在不同年龄Survivin的表达差异无显著性（P>0.05），研究提示Survivin的表达异常可以作为预后不良的标志。
3.2 PTEN在慢性宫颈炎、癌旁组织及宫颈鳞状细胞癌中的表达 PTEN基因定位于人类染色体10q23.3。PTEN利用其脂质磷酸酶活性，使其底物3，4，5－三磷酸肌醇（PIP3）去磷酸化而失活，从而阻止PIP3与蛋白激酶B（PKB）的结合激活，诱导细胞凋亡和周期阻滞。此外，PTEN利用其蛋白磷酸酶活性，使局灶粘附激酶（FAK）脱磷酸，从而抑制整合素介导的细胞粘附和迁移。PTEN尚可使接头蛋白Shc脱磷酸而抑制生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的募集，继之抑制丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）,从而抑制细胞的生长和分化。
有关PTEN与宫颈癌的关系的研究，在国外目前仍处于探索阶段，国内尚未见报道。Su等［10］的结果表明，鳞癌组织PTEN的异常转录为6/30，对应的非癌组织中的异常转录为4/30。Yaginuma等［4］认为PTEN基因的突变在宫颈癌是一个低发事件，1/6的细胞系及1/43的宫颈癌组织呈现mRNA的异常表达。Kurose等［11］的实验表明，有36.8%的原发性宫颈癌发生了LOH，15.0%出现了基因内突变，其中包括纯合性阴性表达，由此认为PTEN与宫颈癌有关。
大量研究表明［12］，PTEN蛋白在多种肿瘤中表达下调，且表达的水平与肿瘤的恶性程度呈负相关。本实验中检测PTEN的表达，其中宫颈癌的阳性表达率显著低于慢鳞组织、癌旁组织（P<0.05），与CIN的表达差异无显著性（P>0.05）；癌旁组织的Survivin阳性表达率显著低于在慢鳞组织的表达（P<0.01），与CIN的表达差异却无显著性（P>0.05），CIN、癌旁组织不典型增生的PTEN表达差异可能也与其发生机制有关，从而提示PTEN表达可能是宫颈癌恶性转化的早期事件。同时本实验发现，从慢鳞→CIN→宫颈癌的演变中，Survivin的表达率是逐渐降低的，而且差异有非常显著性（P<0.01），这表明PTEN的表达丧失可能与宫颈癌的发生、发展密切相关。在PTEN的表达与宫颈癌临床病理特征的关系研究中，本实验结果显示，与宫颈癌的浸润深度、临床分期显著相关（P<0.05），但在不同年龄、组织学分级中，Survivin的表达差异却无显著性（P>0.05），其中在组织学分期高分化、中分化、低分化中，PTEN的阳性表达呈逐渐下降趋势，表明其表达结果可能对判断预后有一定意义。
3.3 Survivin 和 PTEN的表达在CIN、癌旁组织、宫颈鳞状细胞癌中的相关性 本组采用免疫组化方法研究Survivin 和 PTEN在CIN、癌旁组织及宫颈鳞状细胞癌的表达情况及它们的相关性，证实Survivin 和 PTEN在CIN、癌旁组织及宫颈鳞状细胞癌的表达均呈显著的负相关（b1＝-2.603，b2＝-1.466, b3＝-4.060，P<0.05）；从而我们可以看出Survivin 和 PTEN的表达在宫颈癌中的相关性更为密切，提示Survivin 和 PTEN的表达异常可能是宫颈鳞状细胞癌发生、发展的机制之一。
上述研究提示Survivin 和 PTEN在宫颈鳞状细胞癌的早期发生、发展中起重要作用。PTEN是重要的抑癌基因，它的失活可能通过P13K/Akt途径上调Survivin的表达，使之发挥抑制肿瘤和血管内皮细胞凋亡的作用，促进肿瘤细胞的增殖、血管生长和稳定，更有利于肿瘤生长和侵袭。PTEN的失活和Survivin的过表达是宫颈鳞状细胞癌进展和转移的重要环节，可以作为判断宫颈癌预后的标志物。由于宫颈癌和慢鳞中均有Survivin和PTEN的表达，而在正常宫颈组织的表达均阴性，作为宫颈鳞状细胞癌生物学标记缺乏很强特异性。
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作者单位：157000 黑龙江牡丹江，牡丹江市第二人民医院病理科