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来自斯克里普斯研究所的科学家们发现了一种惊人简单及安全的破坏细胞内特异基因的新方法。科学家们证实其可作为实验性基因治疗一种更安全的替代用于对抗HIV感染，由此显示了这一新技术的医疗潜力。相关论文发表在7月1日的《自然方法》（Nature Methods）杂志上。
“我们证实我们可以修饰细胞的基因组，且不会出现长期以来传统基因治疗技术相关的麻烦，”文章的资深作者、斯克里普斯研究所分子生物学和化学教授Carlos F. Barbas III说。
这一新技术采用了锌指核酸酶（ZFN）蛋白，其可以在基因组精确位点结合和切割DNA。当前ZFNs正开始广泛应用于科学实验和潜在疾病治疗，其通常是采用具有潜在风险的基因治疗方法传递到细胞中。
斯克里普斯研究所的科学家将ZFN蛋白直接添加到了培养皿中的细胞上，发现蛋白质进入了细胞，以高效率和最小的附带损害完成了它们的基因剪切功能。
美国国立卫生研究院（NIH）下属国立普通医学科学研究所转录机制基金与NIH先锋奖监管者Michael K. Reddy说：“这项工作消除了有效利用ZFN蛋白作为一种人类基因治疗工具的主要瓶颈。Barbas博士的方法‘简单’测试了这一想法：ZFNs可能具有固有的细胞穿透能力。它证明了Barbas博士极富创意的品性，更一步地验证了将其作为2010年NIH先锋奖得主的选择。”
质疑假设 ZFNs发明于20世纪90年代中期，是由两种类型的蛋白质制成的人工构成物：一种“锌指”结构设计用于结合特异的短DNA序列，和一种可以细胞无法轻易修复的方式在结合位点切割DNA的核酸酶。Barbas在90年代初第一个发明了独创的技术生成了可用于将核酸酶引导至靶向基因的锌指蛋白。
科学家们过去认为ZFN蛋白不能穿过细胞膜，因此标准的ZFN传递方法一直是一种基因治疗技术，采用相对无害的病毒携带设计的ZFN基因进入到细胞中。一旦进入，ZFN基因就会开始生成ZFN蛋白，进而寻找和摧毁细胞DNA中的靶基因。
基因治疗方法的一个危险就是病毒DNA，即便不是逆转录病毒，也可能最终会被随机插入到细胞DNA中，破坏诸如肿瘤抑制基因等有用基因。另一个风险就是这种传递方法，ZFN基因将最终生成太多的ZFN蛋白，导致大量的“脱靶”DNA切割。“病毒传递方法涉及大量脱靶损害，”Barbas说。
在新研究中，Barbas和同事们着手寻找一种更安全的ZFN传递方法，不涉及将病毒或其他遗传材料导入细胞中。他们开始对携带帮助穿透细胞膜的额外蛋白质片段的ZFN蛋白进行了实验，但却发现这些修饰的ZFNs很难以有用的数量生成。最终，科学家们意识到普通ZFNs的锌指部分具有的特性有可能能使蛋白自己穿过细胞膜。
“我们尝试研究了未修饰ZFNs，并且看到它们易于生产，可以相当有效地进入细胞，”Barbas说。
对抗HIV的新策略
接下来，研究小组显示了这一新技术如何能够用于基于ZFN的策略对抗HIV感染。
艾滋病致病逆转录病毒通常通过一种称为CCR5的T细胞表面受体感染T细胞，清除这种受体可使T细胞高度抵抗HIV感染。2006年，柏林的一位HIV患者在接受骨髓移植治疗白血病后不久失去了所有的感染迹象。提供骨髓移植的供体具有一种CCR5基因变异，使得CCR5受体低表达。用基于ZFN的治疗破坏T细胞中的CCR5基因或许能够重现这一戏剧性的效应。
“我们的想法是保护一些患者的T细胞不受HIV感染，使免疫系统仍能强有力地最终清除感染，”Barbas说。
一种利用ZFNs破坏T细胞中CCR5基因，并将修饰T细胞注入患者体内的基因治疗当前正在开展临床试验。Barbas和他的研究小组证实利用他们更为简单的ZFN传递方法可以获得同样的效应。他们将ZFN蛋白直接添加到细胞皿中的人类T细胞上，发现在数小时内相当一部分的ZFN治疗细胞显示出CCR5基因活性急剧减少。
Barbas说在数次应用ZFNs后，借助一种特殊的冷却方法来提高蛋白质穿过细胞膜的能力，科学家们能够以接近基因治疗方法的效率失活CCR5基因。
新方法似乎也更安全。研究小组用于参照的一种基于DNA的方法和其他曾在文献中报道的基于病毒的方法可持续数天生成ZFNs，会造成大量脱靶DNA损伤。而直接传递ZFN蛋白质保留了细胞内完整性，且只有几个小时，造成极小的脱靶损伤。
“在一些脱靶位点基因治疗方法往往会造成损伤，我们没有看到来自这一新技术的任何损害，”Barbas说。
健康“小工厂”的希望
研究小组用各种其他类型的细胞测试了直接的ZFN传递技术，发现它在人类皮肤“成纤维”细胞中以特别高的效率发挥作用。研究人员现在正研究先进的疗法，从患者处获取那样的成纤维细胞，重编程细胞的基因表达模式使它们有效转变为干细胞。这些诱导干细胞随后可以利用ZFNs和其他基因组编辑技术进行修饰。当注入到患者体内，它们能够在长时期内生成数百万的治疗后代细胞。 这种技术有朝一日或可用于治疗各种各样的疾病。Barbas在十多年时间内一直从事抗CCR5策略开发，他希望开始利用基于ZFN的治疗破坏造血干细胞中的CCR5基因。将这些造血干细胞输入到HIV患者体内，成为生成抗HIV T细胞的小工厂。
“即便是少量干细胞携带这种抗HIV特性，也可能最终完全替代患者原始的易受攻击的T细胞群，”他说。
（生物通：何嫱）