反向斑点杂交法助HBV基因型分析

来自重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室的研究人员利用反向斑点杂交技术，设计出特异性基因分型探针，建立了简单、快速、特异地检测HBV基因型的方法，这一方法适合临床上大规模推广使用。

乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染呈世界范围广泛流行，HBV感染不仅可导致急、慢性病毒性肝炎，而且约20%－30%感染者因HBV相关疾病死亡。根据HBV核苷酸全序列异质性8%或s基因序列核苷酸差异度4%，将乙肝病毒株分为A－H8种基因型。不同基因型存在不同的地理分布特征，中国主要以B型和C型为主，其中北方以C型多见，南方以B型多见。另外在我国一些地区还存在少量的基因型A和D。不同HBV基因型在致病性和病毒学特性上存在明显差异。因此，确定慢性乙型肝炎患者体内病毒基因型对于疾病进展的风险预测、治疗方案的选择和患者的临床预后评估具有重要的临床意义。

目前检测  HBV基因型的方法主要有全基因序列分析法、聚合酶链反应限制性片段长度多态性法（polymerase  chain  reactionrestriction  fragmentlengthpolymorphism，PCRRFLP）、PCR基因分型法、单克隆抗体酶联免疫测定法和基因芯片法等，这些方法耗时费力，价格昂贵。

在这篇文章中，研究人员利用反向斑点杂交（reversedotblot，RDB）技术建立了一种简单、快速、特异地检测HBV基因型的方法，而且还可以根据需要继续设计其他型特异性探针，达到对8种基因型的检测，具有广泛的应用前景。

反向斑点杂交（reversedotblot，RDB）技术将特异性探针固化在支持物上，与  PCR扩增后带有标记的待测序列进行杂交，通过显色直接判断结果。这一方法具有快速、简便、敏感和特异的特点，广泛应用于基因突变、病原体及基因分型检测等领域。这种方法无需特殊设备可达到快速检测HBV基因型，经济简便，结果可靠。

研究人员利用这一技术，设计出特异性基因分型探针，并将探针固定在带正电荷的尼龙膜上，与PCR扩增带有地高辛标记的临床血清样本进行杂交。通过优化杂交反应条件，建立起简单、快速、特异地检测HBV基因型的方法。并且还利用该方法对重庆地区临床样本进行分型检测，并与直接测序结果比较，结果表明新建的HBV基因分型方法可对拷贝数在103以上的血清样本准确分型，特异性达到96.67%。

HBV序列分析提示s基因序列稳定，不同基因型各开放读码框中s基因异质性最大，而同一基因型中的各毒株s基因异质性最小，因而s基因适于基因型分型，因此在这篇文章中，研究人员选择  Pres1，Pres2和s区进行分型引物和探针设计。由于乙型肝炎病毒具有高突变率，如果突变发生在探针位置，会出现与探针不完全匹配情况，影响杂交结果。针对这种情况，每种基因型研究人员都设计了3条探针，可避免因异质性带来的漏检，也可以提高检测的准确性，每型只有两条或以上的探针同时显色，才能判断为某种基因型。

另外研究人员还参考分子克隆上的方法，设计并改进了预杂交液和杂交液的配方并对杂交过程所涉及的每一个步骤及试剂的配制进行优化，最终确定了最佳反应条件。除此之外，针对寡核苷酸探针与尼龙膜结合效率低，信号弱的问题，研究人员在探针两端进行同聚物加尾，可明显提高探针结合效率，增强杂交信号。

总而言之，这项研究成功地建立了PCR反向斑点杂交体系，整个过程无需特殊仪器设备，试剂价格低廉（整个费用大概只是HBV测序分型法的一半），操作简单，灵敏度高，特异性强，结果可靠，能对  HBV进行精确的分型，且杂交膜可以预先制备待用，大大缩短了检测时间。从血清病毒核酸的提取到结果的鉴定，一日之内即可完成，适合临床上大规模推广使用。



（生物通：万纹）