癌症危险分析的创新技术

        人类基因组计划完成之后，不同病理状态的遗传和基因组变异分析成为可能。基于“桑格技术”的毛细管基因测序法在时间、成本方面的费用依然很高，并且要求工作人员具备很高的专业知识，国家人类基因组研究所于2004年发起了一个“先进测序技术开发”项目，以达到“1天内用1000美元对一个基因组进行测序”的目的。最新引入的3个商业化可用平台及单分子测序方法，不仅在时间和成本上颇具竞争力，而且比“上一代”的测序技术精确度更高。  



        下一代技术允许的话，在一个实验中，鉴定拷贝数变异和大重组，或融合基因检测分析，就可以在多层次上（基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传学）对癌症的风险进行评估。  



        最近，意大利国家癌症研究中心的S.Tommas等人撰文介绍了癌症危险分析中的这些创新技术。  



        目前，有3个验证平台可供选择：Roche/454FLX、应用生物系统公司的Solid和Illumina/Solexa的基因组分析器（IlluminaGA）。人类基因组计划效率很低，成本估计为30亿美元。  



        桑格测序方法成本约1000元美万；Roche/454平台成本减少10倍，时间缩短20倍；而Illumina公司的系统，可实现10万美元对一个人基因组进行测序。  



        下一代癌症基因组研究  



        通过靶向测序进行基因筛查是一种普遍的诊断做法，但该技术仍然昂贵，并且费时。dHPLC和高分辨熔解（HRM）技术等预检方法，减少了测序反应，已经广泛应用到急性淋巴细胞白血病、肺癌和乳腺癌的研究中。1992年建立起来的比较基因组杂交技术（CGH），标志着癌症遗传学研究新系列的开始。这种分子细胞遗传学方法，对肿瘤细胞中的DNA的拷贝数变化（收益/亏损）进行分析。Progenetix数据库收集了许多癌症类型的核型（Karyotype）信息。例如，卵巢癌基因畸变，由于这种肿瘤的复杂性，即使是一个目标基因的鉴定都很困难。PTEN和PIK3CA基因在子宫内膜亚型中的突变更频繁，而高档浆液性肿瘤（SerousTumors）显示了BRCA1基因的损失。  



        2003年人类基因组计划完成后，用于遗传变异识别的全基因组样品的分析成为可能。全基因组关联研究（GWAS）一般需要两个组：即患者与正常不患病的对照组。频繁的突变被认为与特殊疾病有关联。因为对整个基因组进行筛选，该技术可以一种“非假说驱动”的方式对一种疾病的遗传基因进行调查，但由于大量的统计测试，可能会导致许多假阳性的结果。  



        下一代平台，不但可以在突变级别获得基因组特性，而且也可以在一个独立的试验中检测到大量的排列和复制变异。重测序是与下一代方法的应用之一。最近完成的“1000个基因组项”（http://www.1000genomes.org）和癌症基因组图谱（http://cancergenome.nih.gov），提供了一张人类变异清单，尤其是罕见基因。在癌症研究中，采用的方法是靶向测序（测序靶基因，包括那些显示拷贝数变化的区域）。但是，面临的挑战是诊断和研究实验室之间广泛使用的不同方法的衔接。



        超越基因组  



        癌症的风险分析并不限于基因组研究，它还包括在转录组、蛋白质组和表观遗传学水平中的变化。下一代应用程序的方法见下表。  



        转录组测序是最有趣的新一代系统应用之一。Mane等人采用DNA微阵列和定量RT-PCR技术获得的结果，进行了基因表达的定量比较。定量RT-PCR采用微阵列质量控制（MAQC）参考的RNA样品。他们采用高特异性和灵敏度的Roche/454平台，发现了新的剪切变异体，这样，就以较低的成本，为人转录组学提供了一个更复杂的洞察力。Morrissy等人根据Illumina公司的GenomeAnalyzer平台，开发了一种标签序号方法（Tag-Seq），比癌症基因的表达分析平台LongSAGE更便宜，也更敏感。在这两种方法中，转录体被NiaIII限制性内切酶切割，然后MmeI酶切产生一个21bp的标记。在LongSAGE平台上，标签连接形成“双标签”并且用于测序，而在Tag-Seq方法中，标签是直接测序。SAGE方法中的难点在于连接步骤和克隆。  



        相对于RNA-Seq，Tag-Seq的基因发现也是基于IlluminaGenomeAnalyzer平台，但Tag-Seq可区别正义和反义转录本之间的差异。已知的和新颖的正义-反义基因对在癌症状态和对照组的表达是不一样的，特别是他们发现在Bcl6基因位点的反义转录，与淋巴瘤有关。从乳腺癌患者样本库和二级癌上皮标本显示，该基因位点的正义-反义基因比例有所减少。反义转录的增加可能是由于上皮癌的甲基化，因为该基因位点高度甲基化。  



        转录组的研究不仅可以检测表达的变化，也可以鉴定对基因功能有影响的变种和重排。通过富集方法的靶向测序是转录组研究有效的解决方法，因为据估计，需要4000万读数，才能获得一个覆盖整个转录物组（transcriptome）的一倍覆盖。富集方法是在微阵列表面或溶液中的分子倒置探针（MIPS）和核酸杂交技术。  



        另一个重要的应用是蛋白质和DNA之间相互作用的研究，这一研究方法在基因表达调控中很重要。染色质免疫沉淀（ChIP）方法首次使用是在1988年，最近，一个基于DNA微阵列的ChIP芯片方法已经开始推出使用。该ChIP-chip方法受限于低信噪比，需要对发现的结合部位进行重复确认。  



        最新引入的3个商业化可用平台及单分子测序方法，不仅在时间和成本上颇具竞争力，而且比“上一代”的测序技术精确度更高。