液相色谱的问题解决

液相色谱的问题解决：方法开发，峰形不正，干扰峰
郭丽冰（华东理工大学应用化学系97级 上海 200237）,
施超欧(华东理工大学分析测试中心 上海 200237)翻译
原文：LC-GC Asia Pacific VOL2,No2,1999
    本期的“液相色谱问题解决”对读者提出的一系列问题给予了解答。尽管其中的一些问题具有特殊性，但其解决方法可被普遍采用。例如文中讨论的第一个问题是如何处理一种特殊化合物—苯二甲酸的方法，但此方法可用于含酸的任何样品的处理。
离子对、离子交换或者．．．．．．
问题：我们开发了一种方法来检测食物样品中的苯二甲酸，此法是先对样品进行皂化处理，然后用反相离子对色谱法来分析。经皂化后，基体的酸性非常强。在所有分析方法中，是液相色谱（LC）法最好，还是离子交换色谱法更加适合呢？
解答：对于如苯二甲酸的酸性样品，离子对色谱法是可取的，离子交换色谱法也是可行的，但我选择了从一种较为传统的技术开始。通常我喜欢使方法简洁一些。方法越是简单，引出的问题也就越少。因此，我从反相色谱法开始研究，它使用低pH值的流动相。（如果你决定用离子对或离子交换色谱法，在本节的末尾部分我就这两种方法如何进行添加了一些论述。）
    从15或25cm×4.6mm,5um的C-8或C-18色谱柱开始。我比较喜欢用新型的碱灭活硅烷作为柱填料，而不喜欢旧型的色谱柱，因为碱灭活硅烷对拖尾较不敏感，并且在较宽的pH范围内稳定。为了在离子抑制的环境下操作，流动相的pH值应低于酸的pKa1-1.5个pH单位。苯二甲酸的第一个pKa 为2.9，则需要在pH=1.4-1.9的环境下操作。一般情况下，除非你知道色谱柱在什么环境下是稳定的，否则我们应该尽量避免在pH〈2的环境下操作。我从pH=2.0开始，用25mM的磷酸盐缓冲液作为流动相的水溶液部分，同时用乙腈或甲醇作为有机溶剂。在这些条件下，苯二甲酸未能充分离子化而得不到好的峰形，并且表现得像中性化合物。因为芳香烃的特性，所以用UV检测在255nm应该有可能。
    我较喜欢用搜索梯度来准确本身的流动相强度，正如以前的“液相色谱的确问题解决”和参考文献2所述。用有选择地逐步处理作为方法开发，开始时用90%有机溶剂作为起点，然后有机溶剂含量逐渐下降10%，直到得到合理的保留时间为止。在样品注射前可调节其pH值，使之与流动相的pH值接近。
    低pH值流动相中的离子抑制比在高pH值流动相中的有更多优点。低pH值时，苯二甲酸的离子化受到抑制，所以会表现得像中性分子而其保留时间可预测且得到可接受的峰形。低pH值也抑制固定相中硅醇基团的离子化，这有助于减少峰拖尾。所有的反相色谱柱在3〈pH〈7的范围内是稳定的，而较新型的色谱柱可在2〈pH〈8甚至更宽的范围内操作。
    如果你想在高pH值下操作，你应该知道pH值大于8时柱填料中的碱性硅会溶解。有些色谱柱比其它色谱柱稳定一些，较高的pH值下，封尾的色谱柱比没有封尾的色谱柱更加稳定。在碱性条件下，当用有机缓冲液（如柠檬酸）替代无机缓冲液（如磷酸盐）时色谱柱的稳定性得到改善。一种选择是使用聚合物反相色谱柱。这些聚合物色谱柱对pH值不敏感，但它们趋向于产生比硅胶色谱柱较低的理论塔板数和较宽的峰。
    你提议的离子交换色谱法是在高pH值分离的另一个可能。离子交换相附着在聚合物小球上，具有你寻找的pH值稳定性，但与相应的反相色谱柱比较，其理论塔板数较低。

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