毛细管电色谱及其在药物分析中的应用*

　　毛细管电色谱［1～3］(Capillary Electrochromatography,CEC)是近10年来综合了现代最新分离技术高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)的优势而发展起来的高效电分离微柱液相色谱技术。CEC一般采用熔融石英毛细管，在柱内填充或在柱壁键合固定相，用高压直流电源(或加一定的压力)代替高压泵，即用电渗流(Electroosmotic Flow,EOF)驱动流动相，溶质依据它们在流动相与固定相中的分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得到分离，既能分离中性物质又能分析带电组分。因此，可将它定义为“一种溶质与固定相间的相互作用占主导地位的电泳过程”。CEC是HPLC和CE的有机结合，不仅具有CE水平的高柱效，同时还具有HPLC的选择性。它克服了CE选择性差和分离中性物质的困难，同时大大提高了液相色谱的分离效率，开辟了高效微分离技术的新途径。近年来，随着CEC柱制备技术、分离机制、仪器设备的不断研究和发展，CEC已在分析领域中引起广泛关注，并在有机小分子分离、环境分析、药物分析和生化分析等方面得到应用。本文就CEC的基本原理、研究进展及其在药物分析中的应用作一概述。
1　发展概况
1974年，Pretorius等［4］首先在薄层色谱和液相色谱中应用EOF驱动机制，但并未引起广泛的注意。1981年，Jorgenson等［5］在170 μm内径的毛细管中填充10 μm的ODS固定相，以EOF推动流动相，对中性化合物进行分离，获得31000.m-1理论塔板数的柱效，在此模式下填料的不规则度对区带展宽并不重要。尽管在当时具体实施和操作有相当困难，但作者认为利用EOF进行液相色谱是可行的。1982年，Tsuda等［6］在毛细管壁键合固定相，首次实现电驱动开管液相色谱，即开管电色谱(OT-CEC)，1987年Knox 等［7］用拉伸方法在50 μm内径毛细管中填充5 μm颗料，获得69000.m-1的理论塔板数，并证明了在EOF驱动体系中，可使用更细粒度填料。他们的理论和实验都表明CEC在柱效上明显优于HPLC。
进入90年代，随着CE的全面开展和电色谱柱制备技术的提高，CEC迅速位于分析化学的前沿，因为它集CE和HPLC的优势于一身，无论从柱效、选择性，还是分析速度上，都达到或超过现有的电泳和色谱方法。1992年，Yamamoto等［8］观察到在不降低柱效的前提下，线性EOF速度可增加到3 mm.s-1，保留时间的重现性良好，相对标准差小于2 %。1994年，Smith等［9］进行电色谱分析，在加压下减少气泡形成，柱效为380000.m-1理论塔板数。1995年，Yan等［10］在150 μm内径毛细管中填充90 ％的3 μm ODS和10 ％的1 μm硅胶颗粒，通过激光诱导荧光检测，获得400000.m-1理论塔板数的柱效；Smith等［11］用离子交换固定相在pH<3时分离酸性药物，取得了令人难以置信的8×106.m-1理论塔板数的柱效，展示了非常诱人的前景。近1年来，国内外有关CEC的分离机制、柱制备、应用研究以及全面的综述文章迅速增加［12～36］。并于1997年8月在美国加州召开了第一届毛细管电色谱会议，表明在分析领域中已出现毛细管电色谱这一新的研究热点。
2　基本特性
CEC主要有以下特点：(1)采用的是电场驱动的EOF，EOF扁平的流型较HPLC的抛物线流型有高得多的柱效。(2)没有背压问题，可以使用更小粒度的填料和更长的毛细管柱，具有更高的分辨能力。(3)在高pH下EOF很大，CEC有可能解决大范围中性粒子的分离问题。(4)在分离中性粒子时，CEC不需要像胶束电动色谱(Micellar Electrokinetic Chromatography,MEKC)那样使用表面活性剂，有利于和MS联用。(5)在低pH下，如果选择合适的填料，如离子交换树脂，也可对带电组分达到很好的分离。(6)CEC类似于CE采用在柱检测，检测的死体积很小，有利于提高柱效和检测灵敏度。(7)加压电色谱(PEC)是在加电压的同时，附加一定压力驱动流动相，其优点是避免分离过程中产生气泡，提高稳定性。又可用压力来控制流速，缩短分离时间，并能实现CEC的梯度洗脱［37,38］。(8)目前在HPLC中已使用的分离模式在CEC中均可以实现。
3　分离机制
3.1　保留机理　CEC的保留机理可用下式表示，溶质的迁移速率（uex）为：
(1)
其中
(2)
(3)式中uep和ueo分别为溶质的电泳速度和电渗流，k’为溶质的容量因子，εr和εo分别为相对介电常数和绝对介电常数，ξ和η分别为Zeta电势和流动相的粘度，V、E和L分别为电压、电场强度和色谱柱的总长，q和r分别为溶质的电量和半径。
式(1)表明溶质在柱中的保留是与它在两相中分配常数有关的，因而它是一种色谱行为。但当分析物是离子时，其保留机制又类似于CE，根据其电泳淌度和分配系数的不同得以分离。因而，CEC在选择性和使用范围上兼顾了CE和HPLC的优点。
3.2　柱效　类似于HPLC，CEC的柱效可用Van Deemter方程表征：(4)
式中A项为涡流扩散项，代表在填充床中由于流速的不同而引起的谱带展宽，在EOF推动下，只要毛细管的内径大于20倍的双电层厚度，管中的流速几乎是不随柱径和填料的大小改变的，而双电层的厚度一般为10 nm，所以A项对塔板高度的贡献可以不计。C项为传质阻力项，主要是由溶质在填充微粒内部的扩散系数（Dsz）所决定，Yamamoto等［8］的研究表明在一般操作条件下，C项对塔板高度的贡献也是很小的。那么，在CEC中决定塔板高度的主要是B项，即纵向扩散项。因此，在柱效上CEC远优于HPLC。
3.3　影响分离的因素
3.3.1　电压　在柱长一定的情况下，增大电压则加大EOF，有助于柱效的提高，但电压过高时会导致气泡产生而造成EOF消失。
3.3.2　有机溶剂　向缓冲液中加入乙腈后，溶液的粘度减小，一般随有机溶剂浓度增大，电渗流增加。但是，在流动相中采用不同的溶剂对EOF会产生不同的影响。
3.3.3　pH　EOF随流动相的pH增大而加大。这是因为当pH增大时，毛细管壁上硅醇基电离度增大，Zeta电势增大。因此，可利用高pH达到快速分离。
3.3.4　电解质　随电解质浓度增大，EOF的线速度会因Zeta电势的减小而下降。在提高电解质浓度时，要考虑焦耳热问题。当缓冲溶液中电解质浓度在1～10 m mol.L-1范围内焦耳热的影响较小。Boughtflower等［39］报道了使用两性电解质缓冲溶液，如Tris等，可以在更高浓度(100 m mol.L-1)下操作。
3.3.5　填料粒度　在填料粒度大于1 μm情况下，EOF的速度和流型不会随粒度的减小而改变,故可以采用小颗粒来提高柱效。
4　研究进展
4.1　柱制备　在CEC中，柱制备是很重要的环节，因为柱性能，如柱重复性、柱寿命、柱效等，是实际应用时最关键、最基础的指标。常用方法是柱内填充固定相颗粒，即填充电色谱柱，主要方式有匀浆填充制备法、拉伸填充制备法、电动填充法。填充柱的柱容量大，但塞子效应、气泡、填充均匀度也是无法回避的问题。近来发展的开管电色谱柱［17,24］和连续床电色谱柱［13,21,23］有望解决这些不足。
4.2　梯度洗脱［15,25,37,38］　Behnke等［37］首次在PEC中利用压力驱动实现了CEC系统溶剂的梯度洗脱，不仅大大缩短了分析时间，而且分离的柱效和分辨率均有显著提高，因而能达到梯度模式色谱的高选择性和电泳分离的高效性。Yan等［38］利用计算机控制电压系统，对CEC实现了溶剂的梯度洗脱，可避免HPLC梯度洗脱系统的流体脉动和可压缩性，保证实验数据的准确性和可靠性。
4.3　CEC-MS偶联技术［40,41］　通过CEC-MS联用可以充分发挥2种方法的优势，进一步进行定性和定量分析，特别对难以分析的复杂组分有重要意义。1995年，Lord等［40］首先实现了CEC-MS偶联，分离了用其它方法难以分离的染料。最近，Wu［16,17］以及Ding等［18］将CEC与MS联用分析蛋白、肽、DNA等生物大分子，获得较理想结果。
5　在药物分析中的应用
目前CEC主要用于包括多环芳烃在内的芳香族化合物、染料、蛋白、肽、寡聚核苷酸、氨基酸、对映体等，在药物分析中的应用逐渐增加。对于疏水性强的样品或电泳淌度相近的离子化合物、对映体，CEC体现出强大的分离能力，并在分析速度、重现性、检测限、定量方面达到了应用的要求［42］。
5.1　手性分离　CEC进行手性药物对映体拆分主要有3种方式:(1)非手性固定相结合手性添加剂流动相，手性选择作用依靠流动相中添加的手性选择剂产生［3］。(2)手性固定相［3,43～46］,固定相上键合手性选择剂，如环糊精、蛋白等。(3)手性分子烙印固定相［12,19］，进行记忆性、专一性手性分离。Mayer等［46］在50 μm开管柱内壁涂布键合了γ-CD或β-CD的二甲基聚硅氧烷，在中性条件下，较好地分离了NSAIDs(布洛芬、氟联苯丙酸、芴丙酸、乙哚乙酸）和1-苯乙醇的对映体。Lelievre等［3］用填充法分别制备3 μm ODS普通电色谱柱和5 μm键合HP-β-CD的硅胶颗粒手性电色谱柱，进行了手性固定相和非手性固定相手性分离的比较，在拆分氯噻酮时，手性固定相方式显示出分离时间短、高选择性和高分辨率的优势。另外，Li等［43］用β-CD手性固定相拆分了环己巴比妥、安息香、脱氧核糖蛋白(DNP)-蛋氨酸、DNP-乙硫氨酸和DNP-正亮氨酸的对映体。Li等［44］用键合α1-酸性糖蛋白的手性固定相电色谱柱分离了环己巴比妥、安息香、戊巴比妥、异环磷酰胺、环磷酰胺、双异丙吡胺、美多心安、心得安、心得平和心得舒，并考察了pH、电解质浓度、有机溶剂浓度对保留和手性选择性的影响。Lloyd等［45］在固定相上键合了人血清白蛋白，拆分了安息香、羟基安定。最近，分子烙印技术已开始引用于手性分离，Schweitz等［19］在毛细管柱内填充含有功能性单体、交联剂、烙印分子(如R-心得安、S-美多心安)的聚合物，使其具有单一的记忆特性，可用于相应手性药物的快速分离，如在120 s内可使心得安、美多心安对映体达到基线分离。
5.2　复杂成分分析　复杂成分分析，特别是分子结构相近或电泳淌度接近的混合成分的分离是比较困难，也是非常重要的。近年来CEC在这方面展示了良好的应用前景，Taylor等［15］利用梯度洗脱电色谱较好地分析了生物体液中皮质醇类化合物，在加电压的同时施加1.2 MPa气压，实施加压电色谱并梯度洗脱，生物体液中肾上腺甾酮、氢化可的松、地塞米松、氟考龙等能在较短时间内很好地分离，当样品预处理后，连续进样200次都能获得良好的分析结果。同样地，Taylor等［33］利用梯度洗脱电色谱结合电喷雾离子质谱检测，分离了苯二氮类(安定、硝基安定)、皮质醇类(去炎松、氢化可的松、泼尼松、可的松、甲强龙、倍他米松、地塞米松、肾上腺甾酮、氟考龙、丙米松)和噻嗪类利尿剂(甲苯喹唑酮、氟硫噻嗪、双氢氟噻嗪、苄氟噻嗪、甲氯噻嗪)等药物。
Smith等［9,11］先用ODS反相电色谱柱分析了甾类化合物Fluticasone propionate及其含有的杂质，在提高流动相pH和有机溶剂乙腈浓度后，分析时间明显缩短，并在相近的条件下分析了前列腺素以及合成的中间体和其它杂质，还较好地分离了头孢氨呋肟的非对映异构体。为了更好地分离强极性或带电组分，达到快速高效，用强阳离子交换树脂替代ODS填料，对三环类抗抑郁剂(丙咪嗪、阿米替林、去甲丙咪嗪、去甲替林、甲吡咯嗪、氯丙嗪、苄氟噻嗪)进行分析，获得8×106.m-1理论塔板数，并有效地改善了峰形。Eimer等［47］采用加压电色谱，15 min内分离了抗癫痫药物及其代谢物(ethosuccinimid、扑痫酮、环氧卡马西平、10,11-二羟卡马西平、苯妥英、卡马西平)，10 min内分离了β-受体激动剂(特布他林、酚丙喘宁、克喘素)，还考察了电压、附加压力大小对分离效率和保留时间的影响。作者认为，在加压下可以降低流动相pH，不需要过多考虑电渗流的损失。Euerby等［42］全面考察了电色谱系统的电压、温控、样品进样量、有机溶剂等因素对药物分析的影响，较好地分离了tipredane的非对映异构体，并有很好的重现性，可以达到定量分析的要求。
最近，Lord等［48］采用梯度电色谱柱结合电喷雾离子质谱检测，分析了异羟洋地黄毒苷元、羟基洋地黄毒苷元、华蟾蜍它灵、洋地黄毒苷元、华蟾蜍精、蟾蜍灵等甾类化合物。魏伟等［27］用离子交换电色谱分离盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸小檗碱等生物碱类成分，斑允东［49］尝试用CEC分离中药复杂成分人参皂苷，开始了CEC在中药复杂成分分析中的应用研究。
6　前景展望
80年代以来，HPLC和CE已在分析领域发挥了很大作用，而同时具备HPLC和CE两者优势的CEC，随着其分离机制的不断探索，柱制备技术的研究和完善，各种分离模式的发展，新型专用电色谱仪器的研制，可充分发挥CEC高效快速［50］、选择性强、稳定性好［51］、灵敏度高、样品用量小、流动相消耗少和自动化的优点。通过CEC-MS联用，CEC梯度洗脱，CEC配合DAD、LIF等检测技术，相信CEC作为一种强有力的新兴分析手段，必将在药物分析，特别是在蛋白、多肽类［52,23］药物和中药复杂成分的定性和定量分析中发挥很大作用。
作者单位：中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心　大连　116011
参考文献