饲料中盐酸克伦特罗含量的检测

　　盐酸克伦特罗是一种β－肾上腺能兴奋剂，临床上用于防治哮喘和支气管痉挛。在饲料中添加盐酸克伦特罗具有促进动物生长，提高饲料报酬，提高瘦肉率的效果。但其在肌肉特别是在内脏中会有高浓度的残留，对人与动物的肝、肾及神经系统有一定的毒副作用，欧美各国已禁止将盐酸克伦特罗作为饲料添加剂使用，我国农业部亦已发文作出同样规定。本文采用反相高效液相色谱法，用水相和有机相二次提取饲料中的盐酸克伦特罗，极大地减少了饲料中其它杂质的干扰，取得了较满意的分析结果，为鉴定和检测饲料中的盐酸克伦特罗，打击不法生产者，提供了一个简便而灵敏的分析方法。

1仪器和试剂

　　Waters－515型高压液相色谱仪，带UV检测器及色谱工作站，C18柱，离心机，超声波振荡提取器等。

　　盐酸克伦特罗对照品（含量为99.5％，广州市药品检验所提供）；所用试剂除特殊规定外均为分析纯，所用水应符合GB6682实验室用水规格。试剂包括：甲醇（色谱纯），正己烷，氢氧化钠溶液（5mol/l），盐酸溶液（0.1mol/l）。

2方法与结果

2．1色谱条件

2.1.1分析柱，C－18250mm×4mm；流动相，甲醇，水（65∶35）；检测波长，UV－243nm；流速，0.85ml/min；灵敏度，0.04AUFS；进样量，20μl。

2.1.2分析柱，C－18250mm×4mm；流动相，甲醇，水（55：45）；检测波长，UV－243nm；流速，0.80ml/min；灵敏度，0.04AUFS；进样量，20ml。

　　以上两种条件可选择使用,当使用其中一种条件测定后怀疑样品中含有盐酸克伦特罗时，应用另一种色谱条件再行检测加以确认。

2．2标准曲线及最低检出浓度

　　称取盐酸克伦特罗对照品10mg于100ml量瓶中,用0.1mol/l盐酸溶解并定容至刻度,摇匀,为对照品贮备液。取对照品贮备液1.0ml至100ml量瓶中,用盐酸定容,摇匀,为对照品工作液。从工作液中取1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml于10ml量瓶中,用盐酸稀释至刻度,摇匀,浓度分别为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml，分别进样20μl测定相应的峰面积。当盐酸克伦特罗浓度在0.1μg/ml～1.0μg/ml范围时,浓度与相应的峰面积线性关系良好,回归方程为Y=4484531X＋0.005579,相关系数为0.9995。在本文实验条件下,最低检测浓度为0.05μg/ml。

2．3回收率试验

　　采用标准加入法。取未检测出含盐酸克伦特罗的饲料样品，定量添加盐酸克伦特罗后再进行检测，将检测值除以实际添加值，计算回收率。具体操作如下：取阴性饲料样品20g，精密称定，置100ml量瓶中，准确加入一定量的对照品工作液，混匀，加入盐酸溶液约70ml，浸泡过夜，置超声波摇荡器上20min，用盐酸溶液定容至刻度，摇匀，静置。取上清液离心10min（4000r/min），准确吸取上清液10.0ml,置分液漏斗,滴加氢氧化钠溶液碱化,振摇5min,用正己烷提取二次,每次20ml，合并正己烷层，定容至50ml。从中吸取5.0ml，置水浴蒸干，向残渣中准确加入甲醇适量，使克伦特罗充分溶解，并使其浓度约为0.2μg/ml～0.8μg/ml，经0.45μ微孔滤膜过滤，注入高压液相色谱仪测定。测得回收率为86.5％～94.1％，结果参见表1。

表1回收率测定结果(n=5)

2.4样品的测定

　　按饲料配方自制配合饲料，粉碎后过40目筛，取适量按5mg/kg添加盐酸克伦特罗，充分混合。分别取未添加和已添加盐酸克伦特罗的饲料样品各20g，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸溶液70ml浸泡过夜，以下按回收率项目方法操作，各测定5次。测定结果是未添加盐酸克伦特罗的样品全为阴性，添加了盐酸克伦特罗的样品测定平均结果为4.56mg/kg。CV为3.1％。色谱图见图1。

3讨论

3.1盐酸克伦特罗易溶于水，但由于饲料中成分复杂，若直接用水溶液提取上机，则提取液中含大量杂质，即会污染柱子，也会干扰对盐酸克伦特罗峰的正确判断。本文根据盐酸克伦特罗易溶于水难溶于有机溶剂而克伦特罗易溶于正己烷的特性，采用二次提取方法来溶出和纯化样品，既先用稀盐酸提取出饲料中的盐酸克伦特罗，经离心后碱化，使待测物变为克伦特罗形式，再用正己烷萃取，经浓缩干燥，甲醇溶解后上高效液相色谱仪测定，该法由于采用水相和有机相二次提取，清除了大部分水溶性和脂溶性杂质，减少了干扰，有利于盐酸克伦特罗的鉴别和含量测定。

3.2本方法规定了两种色谱分析条件，其中2.1.1中盐酸克伦特罗的出峰时间及峰形均较为理想，从近50批饲料样品的色谱图看，在克伦特罗峰前后（15min～19min）基本未见其它杂峰，干扰少，可做为首选条件。由于饲料成分复杂多变而且配方不尽相同，因此当使用2.1.1方法定测后怀疑样品中含盐酸克伦特罗时，应按2.1.2的方法再行验证。2.1.2中增加了流动相中水的比例，从而延长了克伦特罗的保留时间，可用于对2.1.1方法的结果进行对比验证，避免误判。

3.3盐酸克伦特罗应避光保存，其稀溶液分解很快，因此配好的对照溶液和样品溶液应尽快测定。