毛细管电泳在食品分析中的应用

毛细管电泳在食品分析中的应用                        

摘　要　介绍了毛细管电泳(CE)在食品分析中的应用。重点介绍了食品中无机阳离子、无机阴离子、有机酸、碳水化合物、维生素、脂肪酸、氨基酸、食品添加剂及农药残留等成分的CE分析方法。并就毛细管电泳法的检出下限、线性和精密度，与其它方法作了比较。
关键词　毛细管电泳　食品分析

  　　毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)是一种以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道的液相分离技术。CE具有极高的灵敏度与分辨率。如采用紫外检测器，其检测下限可达10-13～10-15mol/L；而采用激光制导荧光检测器(LIF)，检测下限可达10-19～10-21mol/L［1］。CE的柱效很高，一般可达到几十万理论塔板数，相比之下，高效液相色谱(HPLC)的柱效仅为几千到几万。CE的分离速度极快，曾有1.7min分析19种阳离子,3.1min分析30种阴离子，4.5 min分析10种蛋白质的报道［1，2］。此外，CE还有进样量少，溶剂消耗少，仪器简单及成本低等多项优点，因此其应用日趋广泛，成为90年代以来发展最快的分析方法之一。
　　食品的多样性及其成分的复杂性对应用于食品分析的方法提出了很高的要求。一个理想的食品分析方法最好可以应用于不同的食品基质，并可测定同一食品基质中不同的复杂食品成分。由于CE具有多种不同的分离体系，可以满足许多食品基质所含的复杂食品成分的分析要求，其分析的对象可以从饮用水到复杂的肉制品，分析的成分可以从简单的金属离子到蛋白质等大分子，再加上CE对被分析成分的提取、纯化及衍生等预处理没有严格的要求,因此,CE在食品分析方面的应用日趋广泛。本文就近年来CE在食品分析中的应用作一综述。

1　离子分析
　　CE在食品分析中应用最广泛和成熟的领域是毛细管离子电泳(capillary ionelectrophoresis, CIE)。CIE实质上是CE最基本的一种分离模式——毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE)在离子分析中的应用。当载体电解质的pH值大于3时，石英毛细管的内表面由于硅醇基的存在而带负电，与载体电解质接触形成外部带正电的双分子层，在高电场作用下，双分子层的水合阳离子导致流体向阴极方向整体移动，从而形成电渗流(eletroosmotic flow, EOF)。EOF是CE的驱动力，其速度一般总大于电解质中任何分子的电泳流速度，因此驱动阳离子和阴离子依次流向阴极，从而达到分离的效果。
1.1　无机阳离子
　　CIE已被用来测定多种食品基质中的无机阳离子。如矿泉水、苹果浆、果汁、花生酱、牛奶、奶酪及奶粉中的K+、Na+、Ca2+、Mg2+等离子［2，3］；饮用水中的K+、Na+、Ca2+、Zn2+及NH4+等离子［2，3］，其中饮用水的Zn2+可与络合离子形成复合体而不需沉淀预处理。CIE亦可检测矿泉水和啤酒中的Se4+、As5+与As3+离子，其中As5+与Se4+的检出下限为12～25 ng/L，As3+的检出下限为800 ng/L，与AAS的灵敏度相当，回收率为88%～116%，相对标准偏差(RSD)为4%～18%［4］。
　　离子化合物的分离选择性由离子当量电导决定。大多数阴离子的当量电导有足够大的差别，可一次完成分离而不受干扰。而各种阳离子之间的当量电导差异较小，因此需要加入阳离子络合剂。阳离子的迁移率会因络合剂的增加而降低。如采用α-羟基异丁酸(HIBA)为阳离子络合剂，共存阳离子如UV-Cat-2(Waters试剂)的迁移率将高于碱金属［5］。因此必须控制络合剂的浓度，以降低弱络合剂与阳离子形成络合物的迁移系数。
　　离子化合物一般用间接紫外法检测，即用带电与被测离子相同且具有紫外吸收的载体电解质作为共存离子，使通过紫外检测器的被测离子区带的背景吸收降低而达到检测的目的。间接紫外法对食品基质中阳离子的检测范围一般为0.6～200 μg/ml(固体样品为0.2～60 mg/g)，最低检测限可达0.05～0.1 μg/ml(固体样品为0.1～0.5 μg/g)，检测下限与离子色谱法(IC)和原子吸收光度计法(AAS)相当。与IC比较RSD为1%～6%，与AAS比较RSD为2%～7%，视不同的食品基质和待测离子而定［2，3］。需要注意的是选择共存离子时应考虑其迁移率应与被测阳离子相近，同时也应考虑阳离子络合剂对离子迁移率的影响。
　　阳离子亦可转化为具有紫外吸收的化合物，用直接紫外法测定。Kajiwara等［6］用直接紫外法检测小麦面筋中的Mg2+和Ca2+离子，检出下限约10-9 mol/L，RSD为2%～4%(与AAS比较)。
　　在载体电解质中加入有机溶剂、水溶性高分子或降低电解质的pH值，均可降低EOF，从而提高阳离子的分离度。如在测定绿茶中的阳离子时，在载体电解质中加入甲醇和18-冠醚-6均可提高分离度，即使茶溶液稀释600倍，仍可检出低于1 μg/ml的K+、Na+、Ca2+、Mg2+及NH4+离子［7］。
1.2　无机阴离子
　　CIE对无机阴阳离子采取不同的分析策略。由于阴离子的电泳方向与EOF方向相反而速度相当，所以很难被检测。如果在电解质缓冲液中加入阳离子表面活性剂，使毛细管壁带正电，则可使EOF反转为自阴极指向阳极。采用阴极进样、阳极检测的方式，可在极短的时间内检测到阴离子。许多脂肪酸季胺盐可充当EOF反向剂，如十二、十四和十六烷基三甲基溴化胺(DTAB、TTAB和CTAB)等［2］。
　　CIE对无机阴离子的分析较为成功。CIE可以测定饮用水、矿泉水、牛奶、可乐、果汁、蔬菜汁、葡萄酒、酱油、面包、咖啡及其它食品中的Br-、SO42-、PO43-、NO2-、NO3-、F-、CO32-等无机阴离子［8～12］。间接紫外法测定食品基质中阴离子的检测下限可达0.1～2 μg/ml，与IC比较，RSD约为2%～10%，但比IC的线性范围宽［8，9］。其中对蔬菜汁和果汁中NO2-和NO3-离子的检出下限可达0.2 μg/ml，定量检出下限为1 μg/ml，RSD为3%～5%［11，12］。
　　CIE检测阴离子的速度非常快。例如用铬酸盐为共存离子，CTAB为EOF反向剂，4.5 min可检出菠菜汁和番茄汁中的15种有机和无机阴离子［11］。由于CIE可避免饮用水中的漂白剂对IC填料的破坏，故在饮用水的无机阴离子检测中，CIE已基本取代了IC方法。CIE也取代了一些强酸性食品(如桔汁)中阴离子的IC方法［9］。
　　食品基质的pH值及待测离子的性质直接影响阴离子的迁移率。一般的阴离子在pH 8.0的电解缓冲液中测定。低迁移率阴离子的测定也常在pH 5～6的缓冲液中进行［2，13］。而蔬菜汁中的阴离子测定则需要在pH 10～11的范围内进行［11］，但如果采用Biij-35等非离子表面活性剂制做的涂层柱，也可在pH 2.3～3的范围内检测［2，13］。

2　营养成分分析
2.1　有机酸
　　CZE广泛用于测定啤酒、果汁、酸奶、蔬菜汁及面包中的多种有机酸(有机阴离子)［14～17］。Kenney等［14］用CZE测定了苹果汁、番茄汁、葡萄汁及其它果酒中的柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸和乳酸。DeVries等［15］测定了啤酒熟化过程中产生的苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、丙二酸和乳酸等有机酸。
　　有机酸的测定方法与无机阴离子类似，也采用间接紫外法进行测定。检测下限可达1 μg/ml，RSD为0.2%～14%不等，取决于不同的食品基质［14，16］。利用计算机控制CE的温度或电压程序，使毛细管中的电解缓冲液形成动态，pH梯度或EOF梯度可大大增加有机酸的分离度［17］。
2.2　碳水化合物
　　碳水化合物一般采用胶束电动力学毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography, MEKC)进行分离。MEKC是CE最主要的的分离模式之一，广泛用于中性化合物的分离和测定。在CZE中，由于中性分子的电泳迁移速度等于EOF速度而无法得到分离。如果在电泳介质中加入形成胶束(micellae)的阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)，中性分子将依据其极性大小在水相与胶束相(拟固定相)之间产生多次色谱类型的分配行为，从而达到分离的效果。
　　MEKC已用于分离和测定各类软饮料、高粱水解液及豌豆提取物中的葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、水苏糖、棉子糖及其它低聚糖类［18～20］。Klochow等［20］以葡糖醛酸为内标，用直接紫外法测定了苹果汁、桔汁和葡萄汁中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，线性检出下限约0.04～0.1 mg/ml，与偶联脉冲安培检测器的高效阴离子交换色谱(HPACE-PAD)比较，RSD为2%～6%。
2.3　维生素
　　CZE和MEKC均可用于检测食品基质中的总抗坏血酸含量。用CZE测定桔汁、葡萄汁和蔬菜汁的抗坏血酸的检测下限为2 μg/ml，有效检测范围为0.1～0.5 mg/ml，RSD为3%，与HPLC相当［21，22］。MEKC测定啤酒、果汁和蔬菜汁中L-抗坏血酸的范围为1～100 μg/ml，其中果汁饮料为0.2～1 mg/ml，检测下限为0.01 mg/g，RSD为0.5%～4%，好于HPLC［23］。此外，CZE也可一次同时检出食品基质中的盐酸吡哆胺、吡哆醇和吡哆醛等多种B族维生素［24，25］。
　　最近Boso等［26］发展了一种新的MEKC方法——微乳化电动力学色谱(microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)，可以同时测定硫胺素、吡哆醇、尼古丁酸、尼古丁胺、VA和VE等多种水溶和脂溶性维生素。这一方法与MEKC的不同之处是在载体电解质中加入极性较弱的有机溶剂，如正己烷、正丁醇和氯仿或其混合物，使之与缓冲液、阴离子表面活性剂及阳离子表面活性剂形成所谓“微乳化油滴”。中性分子(如脂溶性维生素)对“油滴”的亲和能力要强于单纯由SDS形成的胶束，极性分子(如水溶性维生素)在背景电解质和微乳化油滴之间的分配也强于单纯由水相/胶束相组成的分配体系，即其“分离窗口”更大。所以水溶和脂溶性物质在这一体系中均可获得较好的分离。
2.4　游离脂肪酸
　　CZE或MEKC均可分离和测定食品中的游离脂肪酸(FFA)的含量和组成。MEKC方法只能分析C1～C7的FFA［27］，这是因为随FFA链长的增加，其水溶性相应降低并在缓冲液中形成胶束，分离选择性也随之降低。此外，SDS也影响FFA的分离选择性。
　　在CZE的电解缓冲液中加入环糊精(CD)可以增加FFA的选择性。CD可将长链FFA有效固定在CD形成的穴中，FFA的链长越长，其与CD形成络合物的平衡系数就越大，在电泳介质中的迁移率也就越大。在电解缓冲液中加入有机溶剂如甲醇可同时增加FFA在缓冲液中的溶解性。
　　Roldan-Assad和Gareil［28］用CZE分析了椰子油的不饱和脂肪酸组成。在电解缓冲液中加入3-甲基-β-环糊精和多达60%的甲醇，可检出16种只差一个碳原子的C2～C18线性不饱和脂肪酸。
　　由于FFA缺少色团，所以需要用间接紫外法测定，常用的共存离子为β-对甲氧基苯甲酸。间接紫外法检测食品中FFA的检出下限为1～2×10-6 mol/L，与气相色谱(GC)相当，RSD为1%～10%［27，28］，比GC差。
2.5　氨基酸
　　CE用于氨基酸分析的资料较多，但有关食品基质中氨基酸组成和含量的研究较为少见。Michalke等［29］用CZE测定了人奶中的含硫氨基酸含量，发现分离不同的氨基酸所需条件不同。如蛋氨酸在pH 2.5的磷酸缓冲液中可得到分离；而测定胱氨酸则需要在pH 8.0的硼酸缓冲液中进行。该方法的线性检测范围为1～4 μg/ml，但与HPLC相比误差较大，RSD为10%～20%。
　　氨基酸的测定通常采用间接紫外法。间接紫外法虽然避免了衍生步骤，但灵敏度较低［30］。若对氨基酸进行衍生，如采用异硫氰酸荧光素(FITC)衍生，激光制导荧光检测器(LIF)检测，CZE对氨基酸的检出下限可以达到1.3×10-12 mol/L［31］。
　　在一些用标准氨基酸进行的研究中发现，在电解缓冲液中加入CD、冠醚等水溶性高分子或脱氧胆酸盐、甘草次酸等手性表面活性剂不仅可增加氨基酸的分离度，而且可进行D-型或L-型氨基酸的手性分离。Tivesten和Folestad［32］在硼酸缓冲液(pH 8.6)中加入β-CD、γ-CD和10%的甲醇，可使6种D-型和L-型氨基酸标样达到基线分离。

3　食品添加剂和农药残留分析
3.1　防腐剂与甜味剂
　　用CZE可分离和测定浓缩果汁、软饮料、果酱、蚝油和人造黄油中的山梨酸和苯甲酸防腐剂，检测下限约0.06 μg/ml，RSD为0.9%～4%［33～35］。CZE也可同时分析可乐饮料中的阿斯巴甜和糖精，检测下限2～5 μg/ml，RSD约1%～3%，与HPLC相当［35］。
　　在CZE的电解缓冲液中加入聚乙二醇(PEG)等水溶性高分子有助于改善防腐剂的分离度［33］。采用计算机控制pH梯度的CZE系统也可有效分离软饮料中的苯甲酸钠和咖啡因等成分［36］。
　　Thompson等［37］利用MEKC同时分离和测定了无糖软饮料和番茄酱中的山梨酸、苯甲酸、咖啡因、阿斯巴甜和甜蜜素。RSD仅为0.6%～2.6%，测定结果与HPLC极为吻合。该研究表明在MEKC中使用脱氧胆酸钠等手性表面活性剂可有效改善上述防腐剂和甜味剂的分离效果。
3.2　合成色素
　　MEKC已用于分析食品中的各种合成色素。在电解缓冲液中加入CD、脱氧胆酸盐和乙氰均可改善分离效果。Thompson和Trenerry［38］用MEKC测定了糖果中的合成色素，Suzuki等［39］用MEKC结合二级管阵列(PDA)检测器，分析了胭脂红等6种食用合成色素，检测限可低至1 μg/ml，线性范围可达30 μg/ml。
3.3　农药和抗生素残留
　　CZE和MEKC已用于饮用水、牛奶、啤酒、谷物、马铃薯和猪肉等食品中的农药残留和抗生素残留的测定。CZE可测定谷物中的2，4-D等杀草剂残留［40］，采用紫外检测器，检测下限为1 μg/ml，而采用LIF检测器的检测下限可达0.1～0.5 ng/ml。
　　用MEKC结合LIF检测器可在谷物中检出赤霉酸等5种生长调节剂残留［41］，6种敌草隆衍生物残留［42］。检测下限可达0.02～0.04 μg/g，灵敏度高于HPLC。MEKC也可检出饮用水及马铃薯中的对草快和杀草快残留［43］，检测下限为0.2 ng/ml和0.01 μg/g，与GC比较，RSD分别为5%～7%和10%。
　　Blais等［44］用CZE结合LIF检测器检测了牛奶中的氯霉素残留，检测下限低于0.1 ng/ml。CZE分析猪肉中的磺胺残留时，线性检出下限可达2～9 μg/g，在电解缓冲液中加入脱氧胆酸钠可有效改善分离度［45］。
3.4　食品毒素
　　CZE和MEKC已用于测定大豆、鱼及贝类的多胺、次黄嘌呤、黄曲霉毒素、麻痹性贝毒素(saxitoxin)等食品毒素。Locke和Thibault［46］利用毛细管涂层柱结合质谱(MS)检测器，测定了扇贝中的3种麻痹性贝毒素，检测下限可达10 ng/g。

4　结　语
　　食品中的大多数营养成分如无机离子、有机酸、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸等一般具有较强的极性，且大多缺乏色团，所以无论是用GC还是用HPLC分析一般均需要衍生，对样品前处理的要求较高。而食品中的农药残留及其它有害成分的含量甚微，往往需要进行痕量分析，对分析方法的灵敏度也有较高的要求。而CE具有极高的灵敏度，特别适合进行痕量分析，CE对样品的提取、浓缩、纯化和衍生等前处理过程没有严格的要求。除此之外，CE最大的优点是其具有多种不同的分离体系，分析方法极具灵活性，可以满足不同样品基质和待测成分的分析要求。所以CE对食品分析而言是一个极具潜力的分析方法。
　　但是CE与GC或HPLC等色谱方法相比，在定量分析方面仍有一些不足。主要表现在CE的检出上限太低，在进行较高浓度待测成分的定量分析时局限性较大。由于CE的色谱峰太锐，对峰面积的积分往往有较大的误差，故CE的测定误差(RSD)较GC及HPLC大。CE的进样量太少也影响准确的定量。此外，在CE中影响待测组分和载体电解质迁移率的因素很多，所以CE也存在标样的迁移时间漂移较大等问题。
　　要想使CE成为一种简便快捷和高灵敏度的新的食品分析方法，除了从提高精确度的角度出发，进行CE分离体系的理论研究外，在实际的食品分析中多使用CE是十分重要的。

作者单位：杨晓泉　王学兵　张水华  (华南理工大学食品科学系，广州，510641)

参考文献:  (略)


摘自《食品与发酵工业》1999  第5期