猪血小板衍生生长因子的提取和纯化

猪血小板衍生生长因子的提取和纯化

　　摘　要　目的：建立简单、有效的猪血小板衍生生长因子（pPDGF）纯化方法。方法：采用超声裂解、酸醇抽提、离子交换色谱、凝胶色谱等方法提纯pPDGF，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其相对分子质量，并检测其生物学活性。结果：纯化的pPDGF相对分子质量为(2.879～3.078)×10⁴，纯化倍数为7 582倍，活性回收率为3%，比活性为3.411 76×10⁵ U/mg。结论：提取和纯化pPDGF的方法简单，且达到较好的结果，为进一步研究PDGF的理化性质及生物学特性打下基础。

　　关键词：血小板衍生生长因子；色谱法，液相

　　血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）为贮存于血小板α颗粒的一种碱性蛋白，是一种很强的致丝裂因子^［1］。PDGF在创伤修复、动脉粥样硬化、胚胎发生和发育以及肿瘤形成的细胞增殖和细胞定向运动中起着重要的作用。国外已成功地从人血小板中分离出高纯度的PDGF^［2］，但方法复杂，费用较高。本实验采用较为简单的方法从猪血小板中提取和纯化较高纯度的PDGF，为研究猪血小板衍生生长因子( porcine PDGF，pPDGF）的理化和生物学特性及其临床应用打下基础。

1　材料和方法
1.1　pPDGF的提取及纯化
1.1.1　猪血小板裂解制备　新鲜猪血40 L，加6 L ACD液（枸橼酸三钠2.20 g，枸橼酸0.89 g，葡萄糖2.45 g，加蒸馏水至100 ml）抗凝，800×g离心10 min，除去血细胞。将上清用1 500×g离心30 min以沉降血小板，弃上清，用0.01 mol/L PBS洗涤血小板3次，称湿质量。加入100 ml含蛋白酶抑制剂（10% 抑肽酶、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟, Sigma公司）的PBS，用超声细胞粉碎仪（Sonic Materials公司）破碎血小板。
1.1.2　酸醇抽提　按每10 g血小板裂解液加入40 ml酸醇液（95%乙醇375 ml、浓盐酸7.5 ml、双蒸水105 ml），用双蒸水将终体积调至60 ml，4℃搅拌过夜。600×g离心10 min，取上清，将沉淀物再用40 ml酸醇液抽提2 h，离心后取上清。合并两上清液，用氢氧化铵将pH值调为5.3。每85 ml上清液中加入2 mol/L乙酸铵1 ml，再加入2体积冷无水乙醇和4体积冷无水乙醚。-20℃静置48 h，离心后取沉淀，溶于1 mol /L乙酸，冻干备用。
1.1.3　DEAE-Sepharose离子交换层析　阴离子交换基质DEAE-Sepharose FF （Pharmacia公司）装柱2.6 cm×9 cm，用磷酸缓冲液（PB，pH 7.2）平衡层析，将酸醇提取物用0.1 mol/L乙酸溶解，对PB透析，离心后上样，用平衡液洗出穿过峰，用0.25 mol/L和0.5 mol/L NaCl洗脱，分别收集穿过峰和洗脱峰，测活性及蛋白质含量。
1.1.4　热处理　将上一步骤收集的活性物质100℃水浴10 min，1 500×g 4℃下离心1 h，除去变性蛋白质。上清用分子量截留值为1万的超滤膜浓缩，测活性及蛋白质含量。
1.1.5　CM-Sepharose离子交换层析　阳离子交换基质CM-Sepharose FF（Pharmacia公司）装柱2.6 cm×11 cm，用PB（pH 7.2）平衡层析柱，将超滤浓缩液上样，用PB洗出不结合蛋白，以0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl阶梯洗脱，收集活性部分，测活性及蛋白质含量。
1.1.6　Sepharcyl S-100 HR凝胶层析　Sepharcyl S-100 HR（Pharmacia公司） 装柱1 cm×72 cm，预先用1 mol/L乙酸（pH 3.5）平衡。将上一步骤的活性物质对1 mol/L乙酸透析，离心取上清，上样后用平衡液进行洗脱，收集活性部分，测活性及蛋白质含量。
1.2　活性检测　NIH 3T3细胞（第四军医大学西京医院烧伤科实验室提供）用含10%灭活小牛血清的DMEM调至1×10⁵个/ml，接种于96孔板，每孔接种200 μl细胞悬液。CO₂孵箱中培养24 h，换用无血清培养液继续培养24 h，待测样品用含1%灭活牛血清白蛋白的0.01 mol/L乙酸稀释后加入，每孔10 μl，再培养16 h，在培养结束前8 h换入含³H-TdR（中科院上海原子能研究所）的培养液，使每孔终放射性活度为3.7×10⁴ Bq。培养结束后用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维纸上，10%三氯醋酸、无水乙醇、乙醚洗涤，干燥后置于液闪瓶中，每瓶加入5 ml闪烁液（PPO 4 g，PPOP 0.4 g，二甲苯1 000 ml）。在LS6500型闪烁计数仪（Beckman）上进行计数，结果用Bq表示，以引起半数最大³H-TdR掺入值所需的样品含量为一个pPDGF活性单位。
1.3　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）　按Leammli法^［3］将最终分离出的样品进行15% SDS-PAGE，其中部分样品用10% 2-巯基乙醇还原后再进行15% SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色。
1.4　蛋白质含量测定　采用Lowrys法，以牛血清白蛋白为标准品。

2　结　果
2.1　pPDGF的提取和纯化　血小板裂解液经酸醇抽提，比活提高了86倍，活性回收率为51%；经阴离子交换层析、热处理及超滤浓缩，阳离子交换层析，其纯化倍数分别提高了296，299，352倍，活性回收率分别为34%，5%，4%；经S-100HR凝胶层析，纯化倍数进一步提高为7 582倍，活性回收率为3%（表1，图1～3）。样品经100℃水浴10 min，仍保持其生物学活性，表明其热稳定性良好。
2.2　SDS-PAGE　结果显示，从S-100HR分离的活性物质在相对分子质量(2.879～3.078)×10⁴处出现一条明显的蛋白质染色带，比活性3.411 76×10⁵ U/mg。经10% 2-巯基乙醇还原后，SDS-PAGE显示在相对分子质量1.49×10⁴处出现一条蛋白质染色带，且其生物学活性基本消失（图4）。

3　讨　论
　　由于PDGF是一种耐酸、热稳定的阳离子糖蛋白。针对其特殊的理化性质，本实验采用酸醇抽提法从猪血小板裂解液中提取粗制pPDGF，虽然得率不高，但除去了绝大部分的杂蛋白，且纯化倍数为86倍，说明酸醇抽提法是一种有效的提取pPDGF粗制品的方法。根据离子交换层析理论，利用阳离子不结合的DEAE-Sepharose FF层析柱和阳离子结合的CM-Sepharose FF层析柱，并严格控制平衡液的pH值，使其有效地吸附蛋白，除去阴离子，使纯化倍数得到较大的提高。由于PDGF的热稳定性，样品经100℃水浴10 min 和超滤浓缩，此步骤虽然比活性和纯化倍数提高不多，提示有部分活性物质的损失，但基本除去了样品中对热不稳定的蛋白和其他杂蛋白，再经具有分子筛效应的Sepharryl S-100HR凝胶层析纯化可获得较高纯度的pPDGF。15% SDS-PAGE分析，pPDGF的相对分子质量为(2.879～3.078)×10⁴。经生物学活性检测pPDGF可明显促进NIH 3T3细胞的DNA合成。经10% 2-巯基乙醇还原后，pPDGF分解为相对分子质量为1.49×10⁴的蛋白质。这可能是pPDGF二硫键断裂后分解为两条相同分子量的肽链，且还原后的pPDGF生物学活性基本消失。说明pPDGF中的二硫键的二聚体结构对保持其生物学活性起着十分重要的作用。pPDGF具有较好的热稳定性，100℃水浴10 min，仍可保持其生物学活性。

作者简介：任雨笙（1963-），男（汉族），博士， 主治医师

任雨笙（第二军医大学长征医院心血管内科，上海 200003）
陈强（第四军医大学口腔医学院）
贾国良（西京医院）
王增禄（生物技术中心）
张英起（生物技术中心）
李波（生物技术中心）

参考文献

［1］　Pukac L, Huangpu J, Karnovsky MJ， et al. Platelet-derived growth factor-BB, insulin-like growth factor-Ⅰ, and phorbol ester activate different signaling pathways for stimulation of vascular smooth muscle cell migration［J］. Exp Cell Res, 1998, 242(2): 548-560．
［2］　Hart CE, Bailey M, Curtis DA， et al. Purification of PDGF-AB and PDGF-BB from human platelet extracts and identification of all three PDGF dimmers in human platelets［J］. Biochemistry, 1990, 29 (1):166-172．
［3］　Leammli UK. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］. Nature, 1970, 227(5259): 680-683．
［4］　Ross R. Platelet-derived growth factor［J］. Lancet, 1989, 1(8648):1179-1182．
［5］　Poggi A, Rucinski B, James P， et al. Partial purification and characterization of porcine platelet-derived growth factor［J］. Exp Cell Res, 1984,150(2):436-441．
［6］　Hachida M, Zhang X, Lu H， et al. Association between the degree of platelet-derived growth factor-A chain mRNA expression and coronary arteriosclerosis in the transplanted heart［J］. Heart Vessels,1998,13(1):24-29．