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摘要:以NaNO3 为主体流动相在Ultrahydrogel 水溶性凝胶柱上分离、测定了芸芝多糖组分的相对分子质量。文中讨论了流动相离子强度对吸附的影响, 从而建立最佳分离、测试条件, 将芸芝多糖的混合物分离为3 个具有生理活性的组分, 测得各组分的相对分子质量分别为1. 19 ×106 ; 7. 96 ×105 ; 5. 52 ×105 。
关键词:凝胶渗透色谱, 芸芝多糖, 吸附, 相对分子质量
芸芝多糖(PSk) 是从天然产物担子菌纲芸芝中提取的一种混合蛋白多糖(proteoglycan) , 它具有抗肿瘤、抑制动脉硬化、消炎、增强肌体免疫力等生理活性。近年来, 该研究领域吸引了众多日本及欧美的药物研究者,纷纷报道其药效及医用价值[ 1 , 2 ] 。但对多糖相对分子质量( Mr ) 的凝胶渗透色谱法( GPC) 测定尚未见报道。
PSk 是由多组分的多糖组成, 在凝胶色谱柱上存在较严重的吸附现象, 这为准确测试其组分的Mr 带来了干扰, 本文利用水溶性GPC 法系统地考察了流动相的离子强度对柱吸附的影响, 从而建立最佳分离、测试条件。较成功地从芸芝多糖活性成分中分离出3 个组分, 并测定了芸芝多糖各组分的Mr , 为进一步进行组分结构鉴定及其药理研究提供了有用的数据。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
美国Waters ALC/ 244/ GPC 仪, RI 检测器, 810 色谱工作站, 试剂均为AR 级, 高纯水由Millipore 超纯水离子交换器制得。芸芝多糖混合物由第一军医大学提供。
1. 2 色谱条件
色谱柱: Ultrahydrogel - line 柱; Ultrahydrogel - 1000 + 2000 型双柱串联。柱温: 30 ℃; 流动相: 50 mmol/ LNaNO3 ; 流速: 0. 6 mL/ min ; 进样体积: 50μL。
标样: Shodex Pullulan 多糖, 美国出品。
2 结果与讨论
2. 1 流动相的离子强度影响
水溶性凝胶渗透色谱在测定高分子化合物时存在明显的非体积排除效应[3 , 4 ] , 即离子交换、离子排除、离子包含、疏水作用、吸附等, 该效应直接影响Mr 的准确测试, 如何消除吸附或降低吸附至最小程度是水溶性GPC测试的关键。对于未知Mr 的样品, 通常是采用Line 柱进行粗分离, 摸索Mr 大概范围及其分离条件, 再以此条件选择系统的合适孔径柱子进行细分离。针对芸芝多糖是水溶性高分子混合物, 因而选择水溶性Ul-trahydrogel - line 柱摸索分离条件。为了从定量方面说明芸芝多糖在水溶性凝胶柱上是否有吸附及吸附程度,本文用不同离子强度的流动相通过测定流出峰的面积进行比较。表1 为不同离子强度的流动相对芸芝多糖在Ultrahydrogel - line 柱上的吸附影响情况。表1 数据表明由于盐抑制效应, 盐浓度从100 mmol/ L 降低至25 mmol/ L 峰面积逐渐增大, 吸附程度逐渐减少。由Ultrahydrogel - line 柱对分离条件的考察表明(见图1) , 当盐浓度在50 mmol/ L NaNO3 时分离效果较好, 继续降低盐浓度, 峰面积虽然增大但分离效果变差。故最佳离子强度盐浓度为50 mmol/ L NaNO3 。从图1色谱图中可知芸芝多糖活性成分主要由3 个组分组成。
2. 2 色谱柱合理选择
由芸芝多糖在Ultrahydrogel - line 柱上的粗分离最佳条件以及根据凝胶柱的Mr 分离范围, 我们选用Ultrahydrogel - 1000 + 2000 型双柱串联。在上述相应的色谱条件下, 进行色谱柱细分离, 分离情况见图2 , 从图2 中可以看到芸芝多糖混合物获得较好的分离效果。
2. 3 校正曲线制作
配制系列窄分布Pullulan 多糖标样, 其浓度与样品浓度一致, Mr 分别为12. 5 ×105 、8. 50 ×105 、5. 01 ×105 、1. 56 ×105 、6 ×104 、2. 85 ×104 。在相应的色谱条件下得到图3 校正曲线, 曲线拟合公式为log Mr = 13. 35 -2. 540 tR + 0. 285 8 tR2 - 0. 012 62 tR3 ( tR 为保留时间) , 曲线相关系数r = 0. 999。
2. 4 芸芝多糖各组分相对分子质量测定
根据GPC 校正曲线及芸芝多糖色谱流出峰, 可计算芸芝多糖各组分的数均相对分子质量和重均相对分子质量, 本工作均用重均相对分子质量表征, 数据见表2 , 数据表明该测试条件所得数据重现性较好。
2. 5 方法精密度
对芸芝多糖第Ⅱ组分Mr 测定值进行统计处理, 结果为标准偏差s = 0. 105 ×105 , 相对标准偏差sr = 1. 32 % , 对于凝胶渗透色谱测定相对分子质量而言, 数据的相对标准偏差< 5 % , 结果比较理想, 可见该实验方法获得的数据重现性较好[ 5 ] 。
3 结论
(1) 流动相的离子强度直接影响分离物质在凝胶柱上吸附程度, 实验表明适当降低流动相的离子强度可降低芸芝多糖的吸附,有利于相对分子质量的直接测定。分离芸芝多糖最佳离子强度流动相为50 mmol/ LNaNO3 。
(2) 芸芝多糖第Ⅰ组分Mr 为1. 19 ×106 , 第Ⅱ组分Mr 为7. 96 ×105 , 第Ⅲ组分Mr 为5. 52 ×105 。
(3) 本方法标准偏差s = 0. 105 ×105 , 相对标准偏差sr = 1. 32 % , 表明该实验方法获得的数据重现性较
参考文献
1 Nakazato H, Koike A , Saji S. Efficacy of immunochemotherapy as adjuvant treatment after curative resection of gastric cancer. Lancet ,
1994 , 343(6) : 1122
2 Liu S X, Chen Y, Zhou M. Apreliminary study on the enhancement of gene expression of SEGSHPXin mouse peritoneal macrophage
by polysaccharide krestin. J Med Coll PLA , 1994 , 9(1) : 303
3 李静, 张思, 徐卫红. 氨基多糖分子量的测定. 热带海洋研究, 1997 , 5(1) : 26
4 李静, 付时雨, 张汉英. 水溶性凝胶渗透色谱法测定碱木素分子量. 色谱, 1998 , 16(3) : 235
5 陈重臼. 凝胶渗透色谱分析的精度和准确度. 色谱, 1987 , 7(3) : 138