离子对－反相高效液相色谱法测定苄达赖氨酸及其滴眼液的含量

目的：研究离子对-反相高效液相色谱法测定苄达赖氨酸及其滴眼液的含量，增加质量控制手段。方法：采用庚烷磺酸钠作反离子，Alltima C₁₈色谱柱，以甲醇-水-冰醋酸(64∶36∶0.5)，内含0.5 mmol^.L^-1庚烷磺酸钠为流动相，紫外检测波长307 nm，流速1.0 mL^.min^-1，柱温30 ℃。结果：在30～200 μg^.mL^-1浓度范围内呈良好线性，最低检测浓度为0.5 μg^.mL^-1，日内、日间精密度(RSD)分别为0.6%(n=4)和0.9%(n=3)，平均加样回收率为101.7%，RSD=0.8%(n=5)。结论：该方法分析速度快，操作简便，准确，灵敏度高，专属性好， 可作为该药制剂的含量测定方法。
关键词　离子对-反相高效液相色谱法　苄达赖氨酸　苄达赖氨酸滴眼液

苄达赖氨酸(bendazac lysine, BDZL)是一种治疗白内障的眼科新药，其主要作用机理是抑制蛋白质的变性， 并能延缓白内障的进程，可以口服，也可以外用，应用前景广阔^［1］。1997年国内首次研制成功的苄达赖氨酸原料药及其滴眼液， 是获得卫生部批准生产的2个国家级二类新药。 通过药代动力学研究证明，本品局部滴眼能进入眼组织和房水， 并在晶状体内浓集发挥抗白内障作用。有关苄达赖氨酸的含量测定方法， 主要有非水滴定法^［2］，紫外分光光度法^［3］和高效液相－荧光检测法^［4］等。本文首次建立了离子对－反相高效液相色谱法测定苄达赖氨酸及其滴眼液的含量，该方法操作简便、灵敏、准确， 专属性强。
1　仪器与试药
　　美国Waters高效液相色谱仪。510输液泵、484 可变波长紫外检测器，745 B色谱数据处理机，TCM色谱柱温控制仪， 7725 i进样阀(定量管20 μL)，Shimadzu UV-265FW紫外分光光度计。
　　苄达赖氨酸原料药(批号为971210,971230,980106)、 苄达赖氨酸滴眼液（批号为971211，980404，980613)、苄达赖氨酸 对照品(由浙江省药品检验所标定含量为100.0%) 均由平湖制药 厂提供。
　　甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2　色谱条件
　　色谱柱：美国Alltech公司Alltima C₁₈柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)； 流动相：甲醇－水－冰醋酸(64∶36∶0.5)，内含0.5 mmol^.L^-1庚烷磺酸钠；流速：1.0 mL^.min^-1；检测波长：307 nm；纸速：0.25 cm^.min^-1；ATT=256，柱温：30 ℃。
3　实验方法与结果
3.1　系统适用性试验　在给定的色谱条件下，用水分别配制含苄达赖氨酸0.1 mg^.mL^-1的对照品溶液和样品溶液，进样20 μL，色谱图见图1。可见峰形对称，柱效高，保留时间为8.2 min，色谱柱理论板数按苄达赖氨酸峰计算为6 071。

图1　苄达赖氨酸对照品(A)与苄达赖氨酸
滴眼液(B)HPLC图
1.苄达赖氨酸

3.2　线性关系　精密称取经105 ℃干燥至恒重的苄达赖氨酸对照品49.80 mg，置于50 mL量瓶中，水溶解，定容，摇匀，制成贮备液。依次精密吸取贮备液0.3,0.5,1.0,1.5,2.0 mL ， 分置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，记录色谱图，以苄达赖氨酸浓度C(μg^.mL^-1)和相应峰面积A(10^-6)绘制标准曲线，结果表明，当苄达赖氨酸浓度在30～200 μg^.mL^-1范围内呈良好的线性关系，回归方程为：

C=37.39 A+2.08　r=0.999 9

3.3　方法精密度　取上述贮备液5.0 mL，置 50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，连续进样6次，求得苄达赖氨酸峰面积的RSD=0.5%；取此液于同日内不同时间分别取样测定， 求得日内RSD=0.6%(n=4)；日间每隔1 d，每天取样测定1次，连续3 d，求得日间RSD=0.9%(n=3)。
3.4　重现性试验　按含量测定项下的方法，对同一批样品进行多次测定，求得含量的RSD=0.4%(n=5)。
3.5　加样回收试验　精密吸取已知含量的本品滴眼液1 mL(含苄达赖氨酸4.84 mg)，置100 mL量瓶中，添加苄达赖氨酸对照品8.25 mg，用水稀释至刻度，摇匀，照“含量测定”项下方法测定，求得加样回收率为101.7%，RSD=0.8%(n=5)。
3.6　最低检测浓度　按信噪比(S/N)=2时， 最低可检测浓度为0.5　μg^.mL^-1，最小检测量为10　ng。
3.7　样品含量测定　精密吸取本品滴眼液2 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，或取本品原料药约50 mg， 精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀， 精密吸取5 mL，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取经105 ℃干燥至恒重的苄达赖氨酸对照品适量，用水溶解并稀释成浓度为100 μg^.mL^-1的溶液，作为对照品溶液，按给定的色谱条件测定，按外标法的峰面积计算， 结果见表1。

表1　3批原料药及3批滴眼液含量测定结果(%，n=4)

注：括号内为RSD(％)值

4　讨论
4.1　苄达赖氨酸为苄达酸和赖氨酸制成的盐，易溶于水，其分子结构中含有碱性基团，水溶液在(307±1)nm波长处有最大吸收，故部颁药品标准^［2，3］规定原料药采用非水滴定法，滴眼液采用紫外分光光度法测定含量。本文建立了离子对-反相高效液相色谱法，采用紫外检测，通用性强。结果表明， 用本法测得3批原料药与3批滴眼液的含量与部颁药品标准法测得的含量基本一致，但HPLC法专属性强，灵敏度高， 为苄达赖氨酸及其制剂的质量控制提供了一种更为简便、灵敏、准确、可靠的方法。
4.2　流动相条件　实验结果表明，苄达赖氨酸在反相色谱柱中保留能力很强，当用甲醇-水作洗脱剂时，样品进样后不出峰，这可能是硅胶表面残存的硅醇基与苄达赖氨酸分子中的碱性基团牢固吸附之故。经试验， 往流动相中添加少量的庚烷磺酸钠作反离子，用冰醋酸调节流动相的pH， 发现样品进样后不但能够出峰，而且峰形对称。当增加反离子的浓度， 苄达赖氨酸的容量保留因子k′增加；提高流动相中甲醇的比例，k′ 减小，出峰时间缩短，柱效显著增加。另外，增加酸浓度，k′ 不变，但峰形进一步改善，柱效增加。经过反复调整，采用甲醇-水-冰醋酸(64∶36∶0.5)，内含0.5　mmol^.L^-1庚烷磺酸钠作流动相，苄达赖氨酸峰形对称，柱效高(见图1)，保留时间为8.2 min，达到了快速分析的目的。
4.3　另对滴眼液的稳定性作了考察。将样品置于具塞的磨口试管中，于100 ℃沸水浴中加热2 h，取出， 见有白色絮状沉淀生成，振摇即溶解，溶液颜色加深。经用HPLC法测定含量， 结果含量不变，也未见其他杂质峰产生，表明本品热稳定性好。

徐宏祥（浙江省嘉兴市药品检验所　嘉兴　314001）
胡正国 （浙江平湖制药厂　平湖　314200）

参考文献