ＡＦＬＰ技术在食品微生物研究中的应用

　　分类鉴定是微生物学中的一个重要领域,在食品微生物研究中,需要对有益的、腐败的和病原的微生物进行准确的辨别鉴定,从而在食品制造与保藏中,充分利用有益微生物,控制杜绝腐败病原微生物。传统上对微生物的鉴定分类是利用形态学和生理学特征及其差异来进行的,存在诸多局限性。人们一直在考虑将现代分子生物学技术应用到这一领域,从分子、基因水平来研究微生物分类学。近几年来,随着ＤＮＡ指纹技术的迅速发展,对微生物基因组中天然存在的ＤＮＡ多态性的检测方法也越来越多。由于所实验菌株之间的遗传距离可由基因指纹的差异来直接反映,因而检测微生物的ＤＮＡ多态性可用来对其鉴定、分型。

　　扩增片段长度多态性(ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＡＦＬＰ)是1993年由荷兰科学家Ｚａｂｅａｕ和Ｖｏｓ发展起来并获得专利[1]的一种检测ＤＮＡ多态性的新方法。该方法结合了限制片段长度多态性[2](ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＲＦＬＰ)和随机扩增多态ＤＮＡ[3](ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ,ＲＡＰＤ)技术的特点,被认为是迄今为止最有效的分子标记技术。不论所研究的基因组ＤＮＡ是何来源有多复杂,从理论上讲,用ＡＦＬＰ方法都可以检出它们之间的多态性。

　　1ＡＦＬＰ基本原理ＡＦＬＰ的基本原理就是利用ＰＣＲ技术选择性扩增基因组ＤＮＡ双酶切的限制性片段[4]。基因组ＤＮＡ经限制性内切酶消化后,将一双链ＤＮＡ接头(ａｄａｐｔｅｒ)连接于限制性片段的两端。然后根据接头序列和限制位点邻近区域的碱基序列,设计一系列3’末端含数个随机变化的选择性碱基的ＰＣＲ引物进行特异性扩增,只有那些限制位点的侧翼序列与引物3’末端选择碱基相匹配的限制片段才能得以扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离显示其多态性,当不同基因组ＤＮＡ中因突变引起限制位点的数量改变或两个限制位点之间的区域内发生碱基插入、片段消失或顺序重排时,谱带显示多态性。

　　2ＡＦＬＰ反应流程ＡＦＬＰ主要有以下4个步骤组成[5]:基因组ＤＮＡ的酶解(ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ),接头的连接(ｌｉｇａｔｉｏｎｏｆａｄａｐｔｏｒｓ),选择扩增(ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ),凝胶电泳分最后在进行凝胶电泳分析时,选择性扩增产物所形成的ＤＮＡ指纹通常是通过所连接的标记物来检测的,标记物常用的是放射性同位素。为避免放射性同位素造成的危害,科研人员还将荧光标记[6]、溴化乙锭(ＥＢ)染色[7]和银染[8]等标记技术用于ＡＦＬＰ结果分析,使得ＡＦＬＰ技术更为安全可靠。

　　3ＡＦＬＰ在食品微生物研究中的应用由于ＡＦＬＰ结合了ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ各自的优点,方便快速,实验结果既稳定而又可靠。因此,其在微生物研究领域有着极为广泛的应用,主要包括以下几方面:(1)遗传多样性及分类研究;(2)菌种、菌株的鉴定;(3)高密度遗传图谱的构建。有许多细菌能引发食品腐败而导致腹泻或产生其他食物中毒症症状。Ａａｒｔｓ等人(1998)在对62个血清型的78株Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌株进行ＡＦＬＰ指纹分析时,发现所有的血清型都具有独特ＡＦＬＰ指纹图,并且ＡＦＬＰ指纹具有较高的分辨率,可以区分其他方法无法区分的不同菌株。Ｖｅｌａｐｐａｎ等[9]报道了将单酶切ＡＦＬＰ技术(ＳＥＡＦＬＰ)用于对Ｂａｃｉｌｌｉ亚群1,Ｙｅｒｓｉｎｉａ,Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ和Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ菌种和菌株的鉴定。通过仔细地选择ＡＦＬＰ引物,可以在菌株水平得出灵敏、重复性好的鉴定结果。他们认为ＣＥＡＦＬＰ因具有诸多优点,十分适用对病原细菌的快速鉴定。

　　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ是一类分布极为广泛的腐败菌,常见于水果、牛奶、发酵制品中,可引起冷藏食品的腐败变质。为了得到此菌完整的基因图谱,Ｈａｕｂｅｎ等[10]利用ＡＦＬＰ技术对100多株不同来源的Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ菌株进行了研究。结果表明,与它们高度相似的表型特征相反,这些菌株的遗传型差异极大,而仅靠传统的表型特征法根本无法将它们互相区分。在酿造工业中,对所用酵母菌株的鉴定和分类是十分重要的,但在多数情况下又是十分困难的,因为工业菌株很少有基因标记。ＤＮＡ指纹技术的引入很好的解决了上述问题。因为ＤＮＡ多态性是不受培养环境影响的,所以对ＤＮＡ多态性的分析被认为是比生理特征法更为有效的菌株鉴定方法。而ＡＦＬＰ技术由于其诸多的优越性,已成为酵母菌研究中的一个有利工具。