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来源：中国色谱技术网
摘要：建立了毛细管电泳同时分离测定中药石韦中绿原酸、槲皮素含量的分析方法．采用柱端喷壁式三电极系统的电化学检测方式，工作电极为0．5mm碳圆盘电极；参比电极为Ag／AgCl；辅助电极为铂丝电极．以70cm(o．d.360μm，i．d．25μm)的熔融石英毛细管为分离通道，在最佳电泳介质(pH=7.0，10.0mmol／L磷酸盐缓冲溶液)中，当分离电压为21kV时，两待测物质在8min内完全分离．在最佳分离、检测条件下，响应电流与浓度之间的线性关系良好，绿原酸、槲皮素的线性方程分别为：y=0.268x+1.088、y=0.312x+0.822，相关系数大于0.999，绿原酸、槲皮素检测限分别达0.075μg／mL和0.020μg／mL。该方法具有良好的重现性，峰电流的RSD小于3.5%。已成功的用于实际中药石韦和模拟血样中绿原酸、槲皮素的含量测定，结果令人满意。
关键词：毛细管电泳；电化学检测；绿原酸；槲皮素；石韦
天然植物石韦味苦、性微寒，归肺、膀胱经．具有利尿通淋，清热止血的功效。绿原酸(Chlorogenicacid，简称CGA)和槲皮素(Quercetin，简称QC)是石韦中的主要指标成分，绿原酸具有利胆、抗菌、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等功能。槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗病毒、抗癌及抗糖尿病等作用。
已有报道用毛细管电泳-紫外检测法测定了单组分的绿原酸以及混合物中的绿原酸。刘永明等对槲皮素在玻碳电极上伏安行为进行了研究，证明槲皮素在玻碳电极上的反应是准可逆反应。槲皮素和绿原酸同时测定的分析方法还未见报道。
毛细管电泳-电化学检测法(CE-ED)对具有电化学活性的天然药物成分分析具有明显的优越性，灵敏度高、分离效率高、样品不需要预处理，设备简单等特点，不但使常规的中药成分的检测更加便捷，而且为药物代谢动力学研究所需要的血样中痕量代谢产物的测定提供了可能，因此CE-ED联用的分析方法越来越受到中药研究者的重视。
1、实验部分
1．1仪器和试剂
自组装的毛细管电泳-电化学检测系统：高压电源(士3OkV(中国科学院上海原子核研究所)，未涂层熔融石英毛细管(φ25μmx70cm，河北永年光纤厂)，三电极工作系统(O.5mm碳圆盘电极，铂对电极，Ag/AgC1参比电极)，BASLC-4C型电化学检测器(BioanalyticalSystem，WestLafayeRe，In，USA)用于控制恒电位下电化学反应，TL9900色谱工作站(北京泰立化电子技术有限公司)用于处理色谱仪信号数据，pHS-2C型精密酸度计(上海第二分析仪器厂)，超声波清洗器(Branson，USA)。标准品绿原酸和槲皮素均由北京药品生物制品检定所提供；中药石韦采购于福州药店和江西药店；其它实验用化学试剂均为AR级，水为二次蒸馏水。
1．2实验方法
1．2．1标准溶液配制
准确称量1.0mg绿原酸和1.0mg槲皮素，分别用2.0mL乙醇溶解，然后用15mmol／L的磷酸盐(pH=7.0)的缓冲溶液定容至10mL，配制成0.10mg／mL的储备液。
1．2．2样品溶液制备
将一定量的石韦药材洗净、烘干后磨碎．准确称取100mg石韦，用二次水煎煮2h或乙醇提取3h，放置12h，然后，将提取好的石韦过滤，用运行液定容于100mL的容量瓶，备用。分别提取了江西、福州两个产地的石韦。
取健康人血样10mL用高速离心机离心后，取血清部分，即为血液空白样。在血清中准确加人一定量绿原酸和槲皮素标准溶液，振荡、超声5min，精密吸取0.10mL上层清液，用缓冲液稀释至1.0mL，模拟样品中的CGA和QA的浓度均为1.0μg／mL。
所有溶液在使用前均用聚乙烯滤膜(0.22μm)过滤，并经超声波除去细小气泡．
1．2．3毛细管处理
未使用过的毛细管先用0.50mol／L的NaOH溶液活化3h，再用二次水冲洗15min，最后依次用0.050mol／LNaOH、二次水溶液冲洗．每运行5次以后，毛细管先以0.050mol／LNaOH溶液洗3min，再用二次水洗3min，而后换成电泳液施加高压使其平衡稳定3min。21kV下电动进样10s，然后进行分离分析测定．所有实验均在室温下进行。
2、结果与讨论
2．1静态与动态伏安图
电化学检测作为毛细管电泳最灵敏检测方法之一，选择被分析物质的最佳工作电位是非常重要的。为此考察了绿原酸(CGA)和槲皮素(QC)的电化学行为，首先将两个被测物进行循环伏安实验，得到静态伏安图。从图中可以看出绿原酸和槲皮素均有氧化峰，说明两物质均有电化学活性。
进一步考察了在pH7.0，10.0mmol／L磷酸盐(PB)缓冲溶液中绿原酸和槲皮素于碳圆盘电极上的动态伏安图。从图中可以看出，绿原酸和槲皮素的氧化峰电流都随着电极电位的增大而增大。当电极电位低于800mV时，绿原酸和槲皮素产生的峰电流很小，这意味着绿原酸和槲皮素此时在电极上几乎不发生电化学反应。电位范围在800～1000mV时，绿原酸的峰电流急剧增大，而槲皮素的峰电流却增加缓慢。当电位大于1000mV时，绿原酸和槲皮素的响应电流继续增加，然而此时基流也开始急剧增大，这种情况使实验中使用的测量和记录系统难以达到要求，而且很不稳定．因此选1000mV为最佳的工作电位，在此电位下，不仅信噪比最大，而且工作电极可以在较长的时间内保持良好的稳定性．
2．2缓冲液的pH值和浓度的影响
由于离子电荷和粒径取决于溶质在溶液中的溶解、离解、缔和等因素，因此溶质的成分和浓度决定了其在毛细管中的迁移行为；同时，电泳液酸度对毛细管内壁的电荷则起决定作用，因此运行液的性质、酸度和浓度共同决定了分离的电渗流，从而决定了分离效率．分别试验了柠檬酸盐、硼砂、磷酸盐、醋酸盐四种缓冲液对被分析物分离效果的影响，结果表明绿原酸和槲皮素在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的分离效果最好．
进一步考察了酸度对分离的影响，在4.O～9.0范围内PBS的pH值与迁移时间的关系如图所示表明，槲皮素的迁移时间随着pH的增大而增大，而酸度对绿原酸的迁移时间几乎没有影响，因而两者的分离度随pH增大而增大。pH在7.0附近时两组分已经可以完全分离，为了节约分析时间，所以选择最佳酸度为pH7.0。
研究了5.O～25.0mmol／L的缓冲液浓度对分离度及迁移时间的影响，结果标明：随着PBS浓度的降低，两待测物质的迁移时间都随浓度的降低有不同程度的降低。当浓度大于或者等于10.0mmol／L时，绿原酸和槲皮素能得到很好的分离．为了保证较好的分离效果，又节省分离时间，选择10.0mmol／L的PBS(pH7.0)，为最佳运行液。
2．3分离电压和进样量的影响
分离电压对分离时间和分离效果通常也有较大影响。当毛细管长度固定时，迁移时间与外加电压成反比。实验了分离电压为15、18、21、24、27kV时两待测物质的迁移时间，结果表明随着分离电压的增大，两待测物质的迁移时间逐渐减小。高压有利于提高分离速度，可是，过大的电压则使毛细管内电流显著增大，从而引起焦耳热。为了保证分离效率，实验时选择21kV为分离电压。由于本实验采用电动进样，因而进样时间会直接影响到检测灵敏度。在21kV电压下，分别设置进样时间为2、5、10、15s时测量峰高。结果表明，响应峰电流随着进样时间的延长而增大，但当进样时间大于10s时，峰形有明显的展宽，因此选择进样时间为10s(21kV)。
为在最佳条件下绿原酸和槲皮素的标准混合液的电泳图可见，两个被测物在8min内可以达到基线分离。
2．4方法的特性
用CE-ED方法，在上述选定条件下，对一系列不同浓度的绿原酸和槲皮素标准混合样品进行分析测定，以电泳谱图中的峰高Y(nA)分别对绿原酸和槲皮素浓度X(μg／mL)进行回归分析，所得到的绿原酸和槲皮素的线性方程、相关系数及检测限如表所示(每一份样品平均测定5次)。绿原酸和槲皮素的线性范围分别为：0.10～10.0μg／mL和0.050～1O.0μg／mL，其直线方程的相关系数(R2)大于0.999。以三倍信噪比确定绿原酸和槲皮素的检测
限分别为：0.075、0.020μg／mL．表明本方法线性良好，灵敏度高。
2．5天然植物石韦样品测定及其回收率的测定
在上述优化的条件下，按照1．2．2所叙述的方法分别用水或乙醇提取福州、江西两地石韦样品，不需预处理，直接电动进样，实际石韦样品的电泳谱图，对照图标准电泳谱图可知，用水煮法提取的福州石韦样品电泳谱图与标准谱图完全相符，而用乙醇提取的江西石韦样品谱图中的槲皮素的出峰时间延长将近1min，这可能是由于样品带中的乙醇对被测组分迁移时间造成一定的影响。虽然天然药物含有复杂的成分，但因为其中少有容易被电化学氧化的物质，因此电泳图谱中除了绿原酸和槲皮素两组分以外，未出现了明显的非测定物质的谱峰，说明背景物质对石韦样品的测定并没有造成干扰。记录所得的峰电流，根据表1中的回归方程计算，得到的天然药物石韦的分析结果总结于下表。
为了进一步验证毛细管电泳-电化学检测法用于定量分析石韦时的绿原酸和槲皮素的可行性，进行了回收率实验。在1.0mL石韦药材的样品加入1.0、2.0和5.0μg绿原酸；2.O、4.0和10.0μg槲皮素，测定峰电流，根据回归方程计算得绿原酸和槲皮素含量，扣除原来样品中绿原酸和槲皮素的量以后，进行回收率计算，结果列于表可见，石韦药材中的绿原酸和槲皮素回收率在94.5%～105%之间，完全满足实际样品对分析方法的要求，证明该方法用于石韦的测定是准确的、可靠的。
2．6模拟生物体液样品的测定
在上述优化的条件下，按照1．2．2所叙述的方法提取模拟血样以后，不需预处理，直接电动进样分离，人体血样的电泳谱图。通过加标试验，证明电泳谱图中的峰a和峰b分别是绿原酸和槲皮素。血样中不明物质峰对绿原酸和槲皮素的测定不形成干扰。
3、结论
建立了毛细管电泳-电化学检测同时测定石韦中的绿原酸和槲皮素的方法。该法灵敏度高、选择性好，简单、快速，用于模拟血样中绿原酸和槲皮素的分析，结果同样令人满意。因此，该方法不但可作为控制与保障天然药物石韦质量的手段，在药物代谢机理的研究方面也有一定的应用前景。