UPLC SYNAPT二级质谱方法用于siRNA寡核苷酸结构确证

Vera B. Ivleva、Ying Qing Yu和Martin Gilar
美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司

简介 　　RNA干涉（RNAi）机制在转录后基因沉默中有根本性的作用，在已知序列的情况下，基因沉默常规实验可通过使用~21个核苷酸（nt）长度的合成RNAi探针进行，此法也用于研发药物。 合成RNAi寡核苷酸须纯化以防靶点外的基因沉默。RNAi药物需要良好的实验描述，以达到法规要求，将可能的安全有效性的不良作用降低到最小。 　　沃特世超高效液相色谱（UPLC^®）技术的高分离度色谱能力与质谱联用分析是分析siRNA寡核苷酸等生物药物的有力手段。作为寡核苷酸确证的一部分，可通过选择性酶或化学物进行测序。二级质谱碎片分析方法为快速通用方法，可用于修饰后的寡核苷酸（通常对酶切有抵抗力）。为获得完整的21核苷酸RNAi的结构信息，二级质谱分析中其分子须有效离子化并产生与序列相关的离子，质量精确性与分离度也需适当。

　　本应用手册提供了精确UPLC/MS/MS分析方法用于21核苷酸RNA结构确证的流程。该法对确认siRNA碱基药物的序列是非常有用的。

实验条件 样品制备 　　21核苷酸长度的互补RNA链（上游序列5' -UCG UCA AGC GAU UAC AAG GTT -3'，下游序列5' -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3'）在0.1 M乙酸三乙胺（TEAA）中分别重组。合成副产物的分布与上下游序列一并通过UPLC/MS检测。用于UPLC/MS分析的样品浓度为30 pmol/μL。   方法 　　UPLC/MS分析与前述一致。¹沃特世 ACQUITY UPLC^®系统适配了ACQUITY UPLC寡核苷酸分离技术（OST）C₁₈柱（1.7 μm，2.1 x 50 mm ；PN 186003949），质谱参数的选择旨在达到最佳TEA加合物的去聚集效果，而不影响先导离子强度。沃特世SYNAPT™ HDMS™质谱在飞行时间TOF）模式下操作。 选择离子的诱导解离碰撞能量梯度为25 -55 V。MS/MS碎片程度通过选择合适的电荷状态（-3到-6）与不同的碰撞能梯度进行调整。产物离子谱在500 -7000 m/z范围内进行采集，采集率为1次扫描/秒。负离子模式的外部校正使用了碘化铯。使用了MaxEnt™3软件进行了数据分析前的图谱去卷积。   LC条件 LC 体系：     沃特世ACQUITY UPLC 系统 色谱柱：       ACQUITY UPLC OST C₁₈ 1.7 μm，2.1 x 50 mm 柱温：           60 °C 进样量：       5 μL 流速：           0.2 mL/min 流动相A：    15 mM TEA，400 mM HFIP 流动相B：    50% A，50% 甲醇 梯度：           10分钟内B液含量从20-40%
  MS条件 MS系统：            沃特世SYNAPT HDMS 系统 毛细管电压：       2.7 V 样品锥孔电压：    31 V 提取锥孔电压：    3 V 源温度：              120 °C 脱溶剂气温度：    300 °C 脱溶剂气流流速：500 L/h 碰撞阱能量：       6 V 传输碰撞能量：    4 V 质量分辨率：       V 模式下~ 9000（FWHH） LockMass：         CsI 10 mg/mL（水-异丙醇，1：1），流速为5 μL/分钟，扫描时间1秒，频率30 秒，设定质量1685.765 m/z（Cs₆I₇-）   结果与讨论

　　互补RNA21核苷酸链分别进样至UPLC/MS/MS系统，色谱显示了较短的寡核苷酸峰（5'水解产物），它们可以根据原目标21核苷酸得到很好的解析（图1）。成分峰的归属是根据其精确质量测量进行的，可确证部分序列。

　　为鉴定全核苷酸结构，21核苷酸下游链的先导离子[M-4H]^4-进行了分离与碎裂（图2）。主要的特征碎片是互补的c与y离子和低强度[a-B]以及w离子（命名见图3）。上述5'-P-O断裂序列的离子是RNA寡核苷酸MS/MS分析的主要碎片，与DNA产生的产物（主要是3'-C-O断裂的[a-B]与w离子）不同。这是因为DNA分子缺乏2'-羟基。²

　　双链骨架断裂产生的内部碎片与c离子的胞嘧啶中性缺失（表1）显著较少，且对结构鉴定有意义的峰归属没有贡献。上游21核苷酸RNA的MS/MS分析，碰撞能梯度（30-50 V）产生的结果近似（图2）。

　　MS/MS的[M-4H]^4-图谱中所有的碎片离子中，21个核苷酸的RNA通过几种电荷状态表示（表1）。MS/MS图谱的多电荷离子去卷积通过MaxEnt 3软件进行，显著降低了图谱复杂性，简化了MS/MS数据解读。

　　去卷积图谱已足够用于解读整个siRNA序列（图2），还检测到了几个代表了21核苷酸分子离子的A，G与C气相核碱基损失的峰。LockMass校正后质量精确度达到了10 ppm以下，对手工数据解析是很有用的（表1）。三重四级杆质谱的质量分辨率与离子阱仪器可能不能足以进行特征碎片归属以区别多电荷峰与其他寡核苷酸复杂碎片产物。

结论 开发了通过精确质量UPLC/MS/MS进行可靠的测序，以用于siRNA寡核苷酸结构确证的方法。 ■    SYNAPT HDMS系统的高质量精确性与分辨率可达到清晰碎片离子归属要求。 ■    可靠的MS/MS方法可产生特征离子碎片，覆盖了较广的质量范围，足以用于21个核苷酸的siRNA 序列的解析。 ■    MaxEnt 3去卷积软件极大地降低了MS/MS图谱的复杂性，简化了序列解析过程。 本高效确证性测序法对依照美国FDA生物药物化合物规定测定药用寡核苷酸序列十分有用。本法还可能用于计算机测定未知杂质序列。可预计，本MS/MS方法可用于外切酶难以切断的化学修饰寡核苷酸（阶梯测序）。

　　自动化的MS/MS可减少数小时乃至几天的分析时间，降低样品分析成本。另外，UPLC还可快速分离目标RNA类群，多种寡核苷酸链可同时进行MS与MS/MS分析。UPLC分离目标寡核苷酸与其被剪切产物的能力对于siRNA代谢研究是十分有利的。

参考文献 1. UPLC/MS Analysts of Interfering RNA Oligonucleotides. Waterrs Application Note.2008：720002412en. 2. Kirperkar F，Krogh TN. Rapid Commun。Mass Spectrom。2001；15（1）：8-14. 3. Adopted from McLuckey SA, et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom。1992；3（1）60-70. 碰撞能量模式影响了MS/MS碎片产生的程度，能量值须根据对应分析物进行调整。一般来说，用于21核苷酸长度分析物MS/MS碎片化最广的带电状态是-5与-3（1500 -2000 m/z范围内）。25-45 V的碰撞能梯度对21核苷酸RNA产生结构可用的碎片是合适的。 总体上，为获得MS/MS碎片的合理的信噪比（S/N），总离子色谱图（TIC）中主成分或污染物须具有最低500离子数的信号。