用UPLC /MS/MS和UPLC / PDA进行三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸分析

用UPLC /MS/MS和UPLC / PDA进行三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸分析

Mark E. Benvenuti和Aisling O’Connor

沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德

　　引言

　　北美地区最近出现的宠物食品污染事件突出了对宠物食品、动物饲料以及组织样品中的三聚氰胺及其代谢物（三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸）进行快速、确定性分析的必要性。如2007年5月7日的《华盛顿邮报》所述，在美国，未知数量的猫狗因食用了某些品牌的宠物食品而患病或死亡。这导致了数百万磅宠物食品的召回。在食用了受污染宠物食品的动物肾脏内，发现三聚氰胺-三聚氰酸的结晶体迅速形成；这很可能是动物患病甚至死亡的原因。最近，公众强烈要求制造商和政府监管机构采用更准确、快速的分析方法进行食品安全性检测；而此次疾病的突发使这一呼声更加高涨。

　　在证实了此次污染的广泛性之后，美国食品药品管理局（FDA）报告称美国的三聚氰胺存在于面筋和稻米蛋白浓缩物中；这些产品均从中国进口，作为宠物食品使用¹。动物饲料中也受到了三聚氰胺的污染²，这引起了关于受污染产品可能转移至人类食品供应的担忧。

　　本文介绍两种方法：第一种方法是用于分析高浓度目标物质的沃特世^® ACQUITY^®超高效液相色谱（UPLC^®）光电二极管阵列法（PDA）；第二种方法是用于分析ppb级浓度的ACQUITY UPLC^®/MS/MS法。撰写本文时，其中的一种目标物质“三聚氰酸一酰胺”在市面上买不到；因此，未用上述方法对其进行分析。目前认为该化合物与毒性效应无关，因此对分析过程不重要。两种方法均可用不到两分钟的时间给出结果。

　　结果和讨论

　　在含水混合液中，三聚氰胺和三聚氰酸可通过氢键形成晶格结构。这阻碍了对包含这两种化合物的样品进行同步萃取和分析。三聚氰胺不与三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺反应；因此可在一次检测中，同时对这些化合物进行萃取和分析。结果表明：试验部分所述的萃取步骤适用于三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。最近，美国食品药品管理局公布了使用SPE萃取组织样品中的三聚氰酸的详细方法³。

　　试验

　　萃取宠物食品中的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的预备程序

　　称量0.10 -1 g宠物食品

　　在5-10 mL、2%的氢氧化铵溶液中进行萃取

　　用一个0.45微米的注射器式滤器进行过滤

　　将100 μL滤液与900 μL流动相混合后进样

　　三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸由美国TCI公司提供。干狗粮从当地的一家超市中购得。三聚氰酸的标准储备液通过加水溶解而制得。三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的标准储备液通过溶解于0.1%的氢氧化钠水溶液而制得。标准储备液用溶于90/10乙腈／水的混合溶剂中10 mM醋酸铵进行进一步的稀释，以配制出所需的浓度水平。

　　UPLC的条件

　　液相色谱系统：        沃特世ACQUITY UPLC

　　色谱柱：              ACQUITY UPLC BEH HILIC

                      　　2.1 x 100 mm、1.7 μm

　　柱温：                35℃

　　流速：                700 μL/分钟

　　流动相：              溶于90/10乙腈／水的10 mM醋酸铵

　　进样量：              5 μL

　　ACQUITY PDA：         200 -300 nm

　　质谱条件

　　质谱系统：           沃特世ACQUITY TQD

　　软件：               沃特世MassLynx™第4.1版

　　电离模式：           ESI正离子（三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺）

                     　　ESI负离子（三聚氰酸）

　　毛细管电压：         3 kV

　　脱溶剂气：           氮气，900 L／小时

　　锥孔气：             氮气，50 L／小时

　　源温度：             150 ˚C

　　脱溶剂气温度：       400 ˚C

　　采集：               多反应监测（MRM）

　　碰撞气：             氩气，3.5 x 10^-3毫巴

　　对每种化合物采集两种多反应监测（MRM）的跃迁数据。主要跃迁用于定量分析，次要跃迁用于确认。MRM的跃迁、停顿时间、优化后的碰撞能量以及锥孔电压见表1。

　　表1. 受监测的MS/MS离子跃迁（ESI正离子），三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺；（ESI负离子）三聚氰酸

　　第1部分：UPLC /MS/MS分析

　　ACQUITY UPLC-TQD 台顶式串联四极杆质谱仪可用不到1.5分钟的时间完成对三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分离和确认。参见图3。ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱可给出清晰的峰形，从而可对宠物食品和面筋型样品进行可信的定量分析。为实现准确定量，组织样品的分析通常需要使用一种同位素标记型内标。本文未对组织样品的分析进行说明，这是因为目前没有适用于这些化合物的同位素标记型内标。

　　三聚氰酸在另一次检测中进行分析，所用的色谱条件与三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分析条件相同。图4给出了氰尿酸的一幅UPLC/MS/MS色谱图。

　　图5给出了萃取得到的一种三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加标型干狗粮样品。沃特世TargetLynx™应用管理软件可自动处理数据并报告定量分析结果；该软件通过计算每种化合物的主要和次要MRM跃迁之间的离子比，可确定是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。图6给出了关于三聚氰酸二酰胺的TargetLynx浏览器界面。

　　三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的色谱峰可根据保留时间而轻松鉴定，并可通过积分进行定量分析。在图7中，1分钟处的未知峰在221 nm下出现λ最大值。检测三聚氰酸二酰胺的纯标准品时，观察到一个具有相近保留时间和λ最大值的色谱峰；因此认定其为三聚氰酸二酰胺的一种杂质。紧邻三聚氰酸二酰胺峰的第二个未知峰在236 nm下出现λ最大值，与未加标型狗粮的色谱峰相近。

　　除了保留时间的完全匹配之外，通过使用PDA和Empower™软件的UV光谱库功能，也能提高成分鉴别的可信度。图8和图9分别给出了10 ppm三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺标准品以及10 ppm三聚氰酸标准品的光谱指数图。图10给出了一幅用以确认三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加标型宠物食物样品的光谱匹配情况的光谱指数图

　　结论

　　ACQUITY UPLC - 台顶式串联四极杆质谱仪（TQD）可提供更高的灵敏度和质量特异度，从而可用不到2分钟的时间定量检出ppb水平的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。使用次要的MRM离子跃迁可对加标型狗粮中是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺进行确认。由于存在形成三聚氰胺-三聚氰酸结晶体的风险，因此三聚氰酸在另一次色谱检测中进行分析。

　　当不需要较高的灵敏度和质量特异度时，ACQUITY UPLC PDA检测可作为UPLC/MS/MS的一种快速而划算的替代方法。快速分析三聚氰胺及其代谢物的能力可简化与质控或产品合规相关的工作流程。

　　参考文献

　　1.《华盛顿邮报》的网址： http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/2007/05/06/AR2007050601034.html

　　2. FDA的网址： http://www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/petfood.html

　　3. 在线文章：http://www.flworkshop.com/，“用LC-MS/MS测定组织中的三聚氰胺和三聚氰酸的简化方法”，由FDA 方法开发分部的Alexander J. Krynitsky撰写