胎儿软骨中环丙沙星药物浓度RP—HPLC测定法

(解放军总医院临床药理研究室　北京　100853)

　　摘要　　采用反相高效液相色谱法建立了测定胎儿软骨中环丙沙星药物浓度的方法，实验采用Waters HPLC系统，μ Bondapak C₁₈柱，以乙腈—0.02 mol/L磷酸盐缓冲液—三乙胺(30∶70∶0.05)为流动相，内标法定量，在λ＝277 nm进行检测。在31.25～2000 μg/mL范围内环丙沙星和内标峰高比与软骨样本环丙沙星浓度呈良好线性关系(r=0.9990)，方法回收率为99.3 %～103.2 %，日内、日间RSD分别为1.9 %～5.8 %、2.4 %～7.2 %，n=5。用此法测定了10个人工引产胎儿软骨中环丙沙星的浓度
关键词：胎儿　软骨　RP—HPLC　环丙沙星
喹诺酮类药物是临床广泛使用的一类抗生素，但由于在动物研究中发现该类药物特别是第三代喹诺酮类药物对幼龄动物软骨有毒副作用^［1］，所以，对婴幼儿的应用多数持慎重态度。测定胎儿体液和软骨中药物浓度，是研究妊娠妇女服用喹诺酮类药物对胎儿软骨发育影响机理的重要手段之一。环丙沙星体液浓度的测定方法报道较多^［2～4］，而胎儿软骨中环丙沙星浓度的测定法作者未见文献报道，现将胎儿软骨中环丙沙星药物浓度的RP—HPLC测定法及应用此法对10个人工引产胎儿软骨中环丙沙星的浓度测定结果报道如下。
1　药品与试剂
环丙沙星对照品，纯度99.50 %，购自中国药品生物制品检定所。
环丙沙星胶囊，250 mg/粒，市售。
内标对照品(盐酸曲马多)，纯度99.97 %，北京萌蒂医药有限公司赠送。
色谱流动相所用试剂为国产色谱纯试剂。
甲醇为分析纯。
2　仪器
美国Waters HPLC系统：510泵；M484检测器；745积分仪；680梯度控制仪；色谱柱为不锈钢柱(3.9 mm×150 mm)，填料为μ Bondapak C₁₈ 125A。 10 μm(Waters产品)。
3　方法及方法学考察
3.1　胎儿软骨样本的收集和测定样本的制备
10位自愿引产并服用环丙沙星胶囊的孕妇(口服，一次250 mg，一日2次，连服7 d)，于服药第7天施人工引产术，取引产胎儿肩、肘、胯、膝、踝关节软骨(样品的采集和实验均取得家属同意，并签署知情同意书)，用生理盐水荡洗后置于滤纸上擦干。将软骨精确称重，用手术刀粉碎后置于玻璃乳钵中，加入5倍量生理盐水研磨，使软骨成粉末状，将研磨混悬液于10000 r/min离心15 min，吸取上清液，-20 ℃冷藏，待测。
3.2　色谱条件　流动相：乙腈—0.02 mol/L磷酸盐缓冲液—三乙胺(30∶70∶0.05)，用稀磷酸调pH至3.0；流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：277 nm；灵敏度：0.005 AUFS；柱温：室温。
3.3　溶液的配制
内标液的配制：精密称取盐酸曲马多10.0 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取此液1.00 mL，用水稀释至10.0 mL使成100 mg/L内标液。4 ℃避光保存。
环丙沙星标准液的配制：精密称取环丙沙星标准品2.0 mg于1000 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，将此液倍比稀释成31.25～2000 μg/mL环丙沙星标准液，4 ℃避光保存。
3.4　样本药物浓度测定　精取制备的软骨液200 μL，加入100 mg/L盐酸曲马多内标液50 μL，摇匀，加入甲醇200 μL沉淀蛋白，涡旋1 min，10000 r/min离心4 min，精密量取上清液20 μL直接进样测定。色谱图见图1。

图1　色谱图
A.空白软骨液　B.样本软骨液
1.内标(3.89 min)　2.环丙沙星(5.36 min)

3.5　标准曲线和最低检测浓度　取空白胎儿软骨液7份(制备方法同“3.1”)，依次加入环丙沙星标准液，使标准软骨液药物浓度分别为31.25、62.5、125、250、500、1000、2000 μg/L，按“3.4”项下操作，所得数据经回归计算，软骨液药物浓度(C)与药物和内标峰高比(H)的回归方程为：
C＝0.30H＋0.017　r＝0.9990　n=7
在本法条件下，软骨液中环丙沙星的最低检测浓度为8 μg/L。
3.6　方法回收率　取配制的药物浓度分别为31.25、250、2000 μg/L的标准软骨液，按“3.4”项下方法处理，测定峰高比，按回归方程计算实测浓度，连续测定5次，计算回收率。结果见表1。
3.7　精密度　取上述高、中、低标准软骨液，按“3.4”项下方法处理，连续测定5次，计算日内误差；另取上述高、中、低标准软骨液各5份，同法处理，在5 d内连续测定5次，计算日间误差。结果见表2。

表1　软骨液中环丙沙星方法回收率(n=5)

浓度/(μg/L)

平均回收率/%

RSD/%

31.25

103.2

5.3

250

99.7

4.1

2000

99.3

2.5

表2　软骨液中环丙沙星测定精密度(n=5)

浓度/(μg/L)

日内RSD/%

日间RSD/%

31.25

5.8

7.2

250

4.0

4.7

2000

1.9

2.4

3.8　胎儿软骨环丙沙星药物浓度测定　分别取制备好的10个胎儿的软骨液，按“3.4”项下方法处理，测定。结果10个胎儿软骨中环丙沙星浓度分别为0.75、0.37、1.09、0.73、0.43、1.12、0.52、0.87、0.44、0.41 μg/g。

4　讨论
4.1　在本色谱条件下，样本色谱基线平直，内标及环丙沙星在277 nm波长处均有较大吸收，且两峰分离良好，保留时间分别为3.89、5.36 min，无干扰峰出现。见图1。
4.2　胎儿软骨测定样本的制备至少需加5倍量的生理盐水，因为软骨中粘蛋白的影响会使研磨液的粘度增大，离心时不易获得足量的上清液。
4.3　用2倍量甲醇沉淀软骨液中蛋白，可将蛋白沉淀完全，从空白软骨液色谱图(图1—A)可看出，样本经蛋白沉淀后直接进样，基线平直，无任何内源性干扰峰出现。
4.4　环丙沙星是两性物质，在流动相中能解离，对组分的保留和峰形都会造成不良影响，此时在流动相中加入三乙胺以消除柱表面硅羟基的作用^［5］，同时将流动相的pH调至3.0来抑制解离或用来改变峰形。
4.5　应用本文方法对10个胎儿软骨中环丙沙星的测定结果证实，本法操作简单、分离效果好、灵敏度高、准确性和重复性好，是一可靠的测定软骨中环丙沙星浓度的方法。

参考文献
1　　David C Hooper,et al.The fluoroquinolones:pharmacology,clinical use,and toxicities in humans.Antimicrob Agents Chemother,1985,28:716
2　　姚　冰等.高效液相色谱法测定人血清中环丙氟哌酸的含量.药物分析杂志,1992,12(5):270
3　　张敬石等.高效液相色谱测定法和生物测定法用于测定血清中环丙氟哌酸浓度的比较.中国药学杂志,1994,29(8):483
4　　施耀国等.环丙沙星及其代谢物体液浓度的高效液相色谱测定法.中国抗生素杂志,1993,18(3):206
5　　卢佩章等.HPLC法及其专家系统.沈阳：辽宁科学技术出版社,1992.231

(本文于1997年8月25日收到)

RP-HPLC Assay for Ciprofloxacin Concentration in Foetus Cartilagines

Sun Xiaodong and Qu Fen
(Clinical Pharmacology Unit,301 Hospital,Beijing,100853)

　　Abstract:Osteochondrodysplasia fetalis is one of adverse reactions of quinolones.To determine quinolones concentration in cartilagines is a important means for investigating the mechanism of the disease.A sensitive and precise RP-HPLC method for determination of ciprofloxacin in foetus cartilagines was developed.Waters HPLC system and Watersμ Bondapak C₁₈ column and phosphate buffer-acetonitrile-triethylamine as a mobile phase was used.Methodology evaluation shown that ciprofloxacin cartilage concentration between 31.25～2000 μg/L had a good linear coefficient relation(r=0.9990).The detection wavelength was set at 277 nm.The average recovery of the method was 99.3 %～103.2 %.The RSD of within-day and between-days were 1.9 %～5.8 % and 2.4 %～7.2 %.Ciprofloxacin cartilagines concentrations of 10 induced labor foetus were determined with the method.
　　Key words:foetus,cartilage,RP-HPLC,ciprofloxacin

*北京302医院　100039