一种提高高半胱氨酸液相色谱检测灵敏度的方法

A sensitive method for the determination of homocysteine by HPLC

Jie Xinming (Jie XM),Wang Mei (Wang M)(Central Laboratory,Guangdong Medical College,Zhanjiang524023)

　　ABSTRACT　OBJECTIVE:To establish a sesitive method to determine homocysteine by a reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC).METHODS:Homocysteine was determined by RP-HPLC with Fluorescence spectrophotometry.RESULTS:Ophthaladehyde was used as fluorescent derivative reagent.When the reaction took place at 50℃ and pH8.4 for 4 min,the fluorescent intensity reached the highest.In the concentraction of 5×10^-9～2.7×10^-7mol^.L^-1,F%=6.52×10⁹c-0.91,r=0.998,RSD=2.24%,detection limit=4.2×10^-10mol^.L^-1.CONCLUSION:Treated with H₂O₂，the fluorescent intensity of ophthalaldehyde derivatives of HCY may increase by 5 times.

　　KEY　WORDS　homocyteine,HPLC,cardiovascular disease

　　高半胱氨酸(homocysteine,HCY)具有细胞毒性^［1］，其异常升高，会引起血管炎症、动脉粥样硬化 及冠心病等，还继发引起动、静脉血栓及智力发育障碍等。另外，透析患者的血脂和血浆中HCY浓度较高，易引发心血管疾病。由于传统的氨基酸分析方法对HCY灵敏度较低，本实验对HCY进行荧光光谱及液相色谱的研究，试图找出一种分离测定微量HCY的方法。

1　材料与方法

1.1　试剂
HCY(实验试剂，Sigma公司)：1×10^-4mol^.L^-1。邻苯二甲醛(ophthalaldehyde,OPA)40mg，溶于1ml甲醇中，另加入20μl巯基乙醇，定容至10ml。色谱流动相A液：含0.02%三乙胺(TEA)，0.6%四氢呋喃的20mmol^.L^-1醋酸缓冲液(pH7.2)。色谱流动相B液：100mmol^.L^-1醋酸钠缓冲液(pH7.2)-乙腈-甲醇(100∶175∶225)。

1.2　仪器
UV-3101PC扫描分光光度计(Shimadzu)；960型荧光分光光度计(上海第三分析仪器厂)；HP1100高效液相色谱仪(Hewlettpackard)，配1046A荧光检测器，C₁₈反相色谱柱(ODS Hypersil,5μm，125mm×4mm)。

1.3　方法
1.3.1　荧光衍生试剂的试验：用OPA与HCY反应，测定其可见-紫外吸收光谱及荧光光谱。

1.3.2　OPA衍生反应条件的试验　在不同pH、温度、反应时间条件下，用OPA与HCY反应，测定其荧光强度(F%)。

1.3.3　与过氧化氢(H₂O₂)反应的试验　分别吸取0.1mmol^.L^-1HCY溶液0，20，40，60，80，100μl，各加入10μl H₂O₂，室温下反应30min，然后加热蒸干，残渣用200μl硼酸缓冲液(pH8.4)溶解，加入100μl OPA衍生液，定容至5ml。

1.3.4　HPLC分离条件的试验　分别用不同浓度的HCY经过氧化氢处理后，与OPA在HP 1100自动进样器上进行衍生反应，步骤为：取pH8.4的硼酸缓冲溶液5μl，加入经过H₂O₂处理的HCY样品2μl，巯基乙醇1μl,混合10次；加OPA衍生液2μl,混合15次，进样。采用梯度洗脱，条件为：洗脱液B所占比例0min为0%，17min线性增加至60%，17.5min线性增加至100%，20min洗脱结束。激发波长340nm，荧光检测波长450nm。

2　结果与讨论

2.1　荧光衍生试剂的选择
本实验选用OPA作为荧光衍生试剂。OPA反应时间短，灵敏度高，虽然衍生物寿命短，但使用自动进样器严格控制反应时间，可以得到较好的重现性。OPA与HCY衍生物的可见-紫外吸收光谱及荧光光谱分别见图1，2。从光谱图中可见，该衍生物的最佳激发波长为340nm，最大荧光检测波长为450nm。

图1　HCY与OPA衍生物的UV-VIS图谱

图2　HCY与OPA衍生物的荧光图谱

2.2　OPA与HCY衍生条件试验
OPA与HCY的反应方程式如下：

　　分子荧光的影响因素主要有溶剂、温度、pH及荧光寿命等。

2.2.1　温度的影响　温度对荧光强度有显著的影响，通常随温度的下降，由于介质粘度增大，从而使荧光分子与溶剂分子碰撞淬灭机会减少，以及分子内部的能量转换作用，荧光量子产率及荧光强度将增大。但实际上由于有淬灭剂存在时，温度对于分子的扩散、活化、分子内部能量转化以及对于溶液中各种平衡均有一定的影响，故而较为复杂^［2］。本实验就温度对OPA与HCY的衍生物荧光强度作了测定，结果见图3中曲线A。从图中可见，当反应温度为50℃时，荧光强度最大。

图3　反应条件对衍生物荧光强度的影响
A-反应温度对荧光强度的影响；B-反应pH对荧光强度的影响；C-反应时间对荧光强度的影响

2.2.2　pH的影响　由于HCY是一种两性电解质，不同pH将影响其存在状态，并影响与OPA反应的效率。本实验测定了pH7.2～9.0硼酸缓冲液中OPA与HCY衍生物的荧光强度，结果见图3中曲线B。从图中可见，反应在pH8.2～8.7范围内较为合适，最佳pH为8.4。

2.2.3　测定时间的影响　由于OPA与氨基酸的衍生物寿命很短，故掌握准确的测定时间对分析结果影响大。本实验以OPA与HCY反应，每分钟测定一次荧光强度，结果见图3中曲线C。从图中可见反应4min时，荧光最强。

2.3　H₂O₂对OPA与HCY衍生反应的影响
在其它氨基酸共存时，含硫氨基酸的定量是非常困难的。因为在生成异吲哚衍生物时，其巯基将同2-巯基乙醇发生竞争性反应^［3～4］。为此，有人提出了一些化学保护方法，以阻止氨基酸上的巯基参与衍生试剂的反应：①用过甲酸将其氧化^［5～6］。②用碘乙酸或碘乙酰胺将其还原^［7］。③用3，3^′-二硫代二丙酸与含硫氨基酸反应，从而能与OPA反应生成异吲哚衍生物^［8］。本实验试用H₂O₂将HCY氧化成4-磺基丁氨酸，再与OPA进行衍生反应，反应条件：100μl样品+100μlOPA，测量条件：λ_EX＝340nm,λ_EM＝450nm，灵敏度＝3，比例尺＝15，荧光图谱见图4，5。为了防止H₂O₂破坏OPA，氧化反应后应将溶液蒸干以除去过剩的H₂O₂，并在加入OPA前先加巯基乙醇作保护剂。结果表明，经H₂O₂处理后，荧光强度增大5倍。

图4　未经H₂O₂处理的HCY与OPA衍生物的荧光图谱

图5　经H₂O₂处理后HCY与OPA衍生物的荧光图谱

2.4　高效液相色谱条件的选择
血液中HCY含量极微，且共存的干扰物质很多。本实验选用C₁₈反相色谱柱，HCY样品经过氧化氢处理后，用自动进样器控制衍生反应，再经梯度脱，荧光检测。在5.1min可检测到其衍生物色谱峰，见图6。方法在3×10^-9～1.6×10^-7mol^.L^-1浓度范围内，F %=6.52×10⁹ c-0.91，r=0.998,RSD=2.24%，检测限为4.2×10^-10mol^.L^-1。

图6　H₂O₂处理后HCY与OPA衍生物的HPLC图谱

　　试验结果表明，使用OPA作荧光衍生试剂，HCY经H₂O₂氧化处理后，衍生物荧光强度可提高5倍。该法可望用于患者血清中微量HCY的测定，为早期诊断血栓形成、冠心病及预防血透患者易发心血管疾病提供一种新方法。

作者单位：揭新明　王媚 (湛江524023广东医学院中心实验室)

参考文献
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[2]　陈国珍，黄贤智，郑朱梓，等.荧光分析法.北京：科学出版社，1990：56.
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[4]　Alvarez-Coque MCG.Formation and instability of ophtha-laldehyde devivatives of aminoacid.Anal Biochem,1989,178(1):1.
[5]　SchramE,MooreS,Bigwood EJ.Chromatographic determination of cystineas cystric acid.J Biochem,1954,57(1):33.
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[7]　Gurd FRN.Carboxy methylation.Methods Enzymol,1972,25(1):424.
[8]　Barkholt V.Amino acid analysis:determination of cysteine plus halfcystine in proteins after hydrochloric acid hydrolysis with a disulfide compound as additive.Anal Biochem,1989,177(2):318.

(收稿：1998-03-20)