项目详谈之 苯甲酸、山梨酸、糖精钠

苯甲酸、山梨酸是常见的防腐剂项目，在工业中常以苯甲酸钠、山梨酸钾形式加入。
    山梨酸学名已二烯[2、4]酸，别名花楸酸，其结构式为CH3－CH＝CH－CH＝CH－COOH，分子量为112.13，是具有特殊气味的白色单斜晶结晶，熔点132℃至135℃。
    苯甲酸结构式为C6H5－COOH，别名安息香酸，分子量122.12，是白色的有光泽的单斜晶结晶的薄片或针状。熔点121℃至123℃。
     我们应该比较清楚地了解到苯甲酸与苯甲酸钠，山梨酸与山梨酸钾的关系。在食品中添加防腐剂通常以苯甲酸钠、山梨酸钾形式加入，它们不易汽化，易溶于水，但不溶于甲醇、乙醇等常见有机试剂；而苯甲酸、山梨酸易汽化，易溶于有机试剂，但是几乎不溶于水。初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠，用水溶解苯甲酸，晃了半天才发现还没溶解。
    苯甲酸、山梨酸的色谱仪器检测方法有气相色谱法和液相色谱法。气相色谱法只能检测苯甲酸、山梨酸；而液相色谱法可以检测苯甲酸、山梨酸，还可检测其盐的形式。
苯甲酸、山梨酸的检测可见GB/T5009.29-1996  (食品中山梨酸、苯甲酸的测定方法)，按此方法即可进行实验。但有几点值得注意：
  1．苯甲酸、山梨酸的应用范围
    首先应注意到，并不是所有食品都需要加入防腐剂，只有那些富含营养物质，且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要，否则对厂家来说会增加不必要的成本。
酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完，月饼等需在货架上摆放，如不加防腐剂很快会发霉变质，有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕，即在细菌大量繁殖前己被消化了，因而没有添加的必要。
苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用，含量就不能太低。如果我们检测样品时只有几个ppm的浓度，有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的，而不是厂家出于防腐目的加入的。
苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲酸、山梨酸，有可能使用防霉剂，或其它种类的防腐剂，或自行规定需冷藏（如某些月饼）。
    2．样品处理的注意事项
    应该说，GB/T5009.29-1996  (食品中山梨酸、苯甲酸的测定方法)在文字结构上有缺陷，液相色谱法测定苯甲酸、山梨酸只讲述了液体样品的处理方法，而对于固体样品看来只能用薄层色谱法了。这时只能用薄层法的方法处理样品后再去上机了。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。这类样品处理的关键在于如何尽量排除油脂、蛋白质，且尽量不影响待测物的回收率。即找到一种较理想的沉淀剂。
    GB/T5009.29-1996使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于营养成分较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则力度不够。如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果稍好；如用10％亚铁氰化钾和20％醋酸锌溶液则效果理想（这是笔者目前用过最好的沉淀剂）
    具体步骤如下：
    取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品5.0 克于250ml碘量瓶中，加水30ml，振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L)1.0 ml，加入9.5mL10%亚铁氰化钾, 9.50mL 20%乙酸锌, 放置过夜,振荡使其充分混合后,用滤纸初滤沉淀物, 初滤液过0.45μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中。
    用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；最大的缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限性。
    3．检测仪器的选择
    虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。原因如下：
  ① 液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。尤其对于高油脂样品（如月饼）若采用碱化－排油－酸化－提取－挥干－溶解等步骤，再上气相色谱仪检测，工作量实在太大，毒性也大，且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。
  ②液相色谱法在完全同样的样品步骤及仪器条件下，还可同时完成糖精钠项目的检测，这是气相色谱法不可比拟的。
  ③液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏得多，可进行更低含量的检测。如用二极管阵列检测器，还可辅助定性，这更是FID检测器不可媲美的。
  4．选用气相色谱仪的注意事项
    GB/T5009.29-1996所用的色谱柱为  5％DEGS＋1％磷酸固定液的60－80目 Chromosorb W AW，（想一下，为什么柱中有磷酸？）。这种柱在使用时有两个特点：①稳定慢。如果GDX－102柱要稳定30分钟，那它起码要3－4个小时。②性能稳定，重复性好，可以得到异常准确的保留时间。
    该柱的适用溶剂为石油醚或乙醚，不太适用甲醇或乙醇，拖尾效应太大了。
如用毛细管柱，能取得更好的峰形和灵敏度，但其稳定性及特异性不如填充柱。一般可用非极性毛细管柱，0.530mm内径，10－15m长度。色谱条件可能需用程序升温。
    气相色谱上的出峰次序为先出山梨酸，后出苯甲酸。
  5．选用液相色谱仪的注意事项
    按照GB/T5009.29-1996，流动相应为5：95的甲醇：0.02M醋酸铵溶液，但是这个比例仅是个参考值，我们在工作中应根据实际情况进行调节。
    为什么用甲醇溶液？甲醇有两个作用，①防腐，液相色谱柱最怕流动相长菌，尤其霉菌。甲醇可使蛋白质变性，有杀菌作用。②调节流动相极性，这是最重要的一点。甲醇在溶液中比例的些少变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变，因此可以通过改变流动相中甲醇含量，以调节这几个组分的出峰和分离，以得到较理想的色谱图。
    5：95是一个通用的比例，如减少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢，扩散效应增大，峰形较差，但这三组分的分离情况较好。如增加甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间提前，扩散效应较小，峰形尖锐，但这三组分的分离情况可能受影响，产生重叠。在选择条件时，只能通过实验手段，如配制3：97，4：96，5：95，6：96，7：93的流动相，综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。
    不同柱的最适比例不同，举例来说，色谱科公司的液相柱最适比例为4：96，而岛津公司液相柱的最佳比例为7：93。就是同一根柱，一年前和一年后的极性也会有变化，需调节溶液配比。
为什么使用0.02M醋酸铵溶液？加入醋酸铵是为了调节离子强度，使待测物的峰形不致于变坏。如果单独检测苯甲酸和糖精钠，加不加醋酸铵没有什么关系，都可以得到较好的峰形；但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵，否则得不到一个完整的色谱峰，峰形呈破裂状。
    醋酸铵溶液浓度不需严格控制，0.01M、0.02M、0.04M均可。
    苯甲酸、山梨酸、糖精钠在液相上的出峰次序很有特点。在流动相5：95及以下比例时，次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠（注意一下气相的出峰次序），逐步增大甲醇含量，苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前，而糖精钠是属于迅速提前，随着甲醇比例的逐步增大（15％－30％），原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠，并位于最前面，其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度，次序不变。
    用高甲醇比例条件（甲醇15％以上）做出的三种标准物质色谱图看起来很好，峰出的也快，但做样品时干扰很大；因此建议尽量使用低甲醇比例条件（甲醇5％左右）。
    6．防腐剂超标样品的判断
    防腐剂超标的样品较多，由于它们往往牵涉到一批货物是否合格，因此责任很重大。由于该方法定量较准确，因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。
如同时有气相色谱仪和液相色谱仪，建议用这两种性质相差很大的仪器进行对照，如定量结果差不多，即可确认。
    如只有气相色谱仪，利用其在填充柱保留时间稳定的特性，同时进五针标准液和五针样品液（注：峰面积应差不多，否则需对一方按比例稀释），如标准和样品液的保留时间相差时间超过1 秒，可认为不是。（如扎针的技术不过关，请不要做此实验）
    如用液相色谱仪，当检测器为二极管阵列检测器时，根据保留时间和紫外吸收图结合定性，当只有紫外检测器时，改检测波长为220nm，230nm，250nm，重复进标准和样品液，由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。
    如有微生物检测手段，可加样品于有菌培养基中，观察有无抑菌现象，如无抑菌现象则无防腐剂。
    不是很推荐用双柱法，因为有时柱极性相差不大，反而会影响最终判断。
    7．糖精钠超标样品的判断
    除了采用二极管阵列检测器或波长验证外，还有一个极为简单、却相当有效的方法，即感官法。糖精钠是一种甜味剂，用舌头可以感觉到它的甜味，如果含量超标，一定能尝出来。
    如果有荧光检测器就更好了，可以利用糖精钠的荧光性质辅助定性。一般来说，激发波长为277nm，萤光波长为410nm。如果用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多，才可以判断为是。
    8  ．标准溶液的贮存问题
     苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体，一般几个月后会失效，降解严重。如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层，可保存一两年。