液相色谱-质谱联用研究中药人参化学物质基础

液相色谱-质谱联用研究中药人参化学物质基础 引言 在确定化合物结构的几种工具和手段中，质谱是唯一能够确定分子量以至分子式的办法。高分辨的质谱能够直接给出分子式，低分辨的质谱可以确定分子量，并在其他手段的协助下确定分子式及其相应的分子结构。 质谱仪是由离子源和质量分析检测部分组成的。离子源的种类有很多，常见的有电子轰击（EI）、化学电离（CI）、场解吸（FD）、快原子轰击（FAB）等。后来又出现了用于液质联用的电喷雾（ESI）和大气压化学电离（APCI），近年来得到迅猛的发展。质量分析检测部分有磁质谱、四极杆质谱、时间飞行质谱等[1]。 在快原子轰击质谱（Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry FAB-MS）没有出现以前，色质联用技术只有气相色谱-质谱的联用得到充分的发展，而GC-MS只能测定挥发性或半挥发性的化合物，而且测定分子量的范围很小。对完全不能挥发的样品要经过衍生化反应生成可挥发的化合物后在、再进行分析。1981年FAB出现以后用于不挥发和热不稳定的糖甙类、多肽、小蛋白质等的分析打开了一个崭新的局面[20]。作为质谱的软电离方式之一，FAB是将样品溶于一定的溶剂中加在底物中（很多情况下用甘油），涂于FAB靶上，快原子轰击靶使样品电离，进入质量分析系统进行分析[2]。FAB-MS用于不挥发和热不稳定样品的分析已有成功的实例，如对人参皂甙类化合物的分析[3]。 随着LC-MS接口技术的日臻成熟，对热不稳定和难挥发的样品，用LC-MS可以很容易地实现对这类样品的分析。目前常用的LC-MS的接口有几种，如大气压化学电离（APCI）、电喷雾（ESI）、热喷雾（Thermospray TS）、颗粒束（Particle Beam PB）等[4]。但是从分析的灵敏度、适应的样品的极性范围以及与HPLC的兼容性等几个方面综合考虑，APCI和ESI是它们中间的佼佼者。APCI是接口同时也是离子源，其工作原理[5]是从液相色谱来的流动相携带着样品流出联接毛细管时，流动相被脱溶剂的气体雾化并在加热的套管中进一步挥发，气化后的溶剂分子在加热套管的末端的电晕放电形成的等离子体区域，样品在经过等离子体区域时会发生质子转移，从而被电离成[M+H]-或[M-H]+离子，被电离的分子在电场的作用下经采样孔收集进入离子室，进入质谱被检测。ESI接口同时也是离子源，其工作原理是[6，7]流动相进入电喷雾口的毛细管末端时，在脱溶剂气体的吹扫下，迅速形成雾状气溶胶，而毛细管末端的数千伏高压电形成的电场使气溶胶中的小液滴表面带上电荷，随着溶剂的不断挥发，液滴表面的电荷积聚并产生强烈的排斥，最终样品会从液滴的表面溅射出来形成带电离子，进入质谱被检测。 随着仪器和技术的发展，新型的质谱仪不断涌现[8]。多级串联质谱仪（Multiple-Stage Tandem Mass Spectrometer）如三级四极杆质谱（Triple-Stage Quadrapole TSQ）、四极杆-正交加速飞行时间质谱仪（Hybrid Quadrepole-Orthogonal Acceleration Time Of Flight Q-TOF）四极杆-离子阱（Ion-Trap）等，都具有强大的功能，只是由于目前价格昂贵，普及应用受到限制。 用质谱的方法对中药组分进行定性分析，除了挥发性成分在气相色谱-质谱联用（GC-MS）中取得一定成功[9-12]之外中药的其它组分以液质联用方法分析的报道并不多，这主要是受仪器条件的限制，但近年来已经呈现逐年增多的趋势[13-18]，说明了LC-MS是解决中药化学物质基础这一难题的有力工具。 中药中不易挥发的的化学成分，适合做LC分析，在经液相色谱分离后，经由检测器被检测时，通用型检测器如示差折光检测器不能给出任何结构信息，没有标准品的组分很难定性。紫外检测器是一种选择型检测器，具有紫外吸收的物质的紫外光谱图反映了它们的结构信息，尤其是光电二极管阵列检测器（PDA）可以选择提取某一波长范围的紫外光谱图，对有特征紫外吸收的化合物的定性很有帮助，前面一章已提到紫外光谱辅助定性的内容。但是，由于有些物质没有紫外吸收或者紫外吸收的特征不明显，对这类物质的定性，紫外光谱仍力不从心。液相色谱-质谱联用（LC-MS）的出现改变了这种局面。软电离的LC-MS可以很容易给出物质的分子离子峰，从而定出分子量。另外，还可以对某一分子作出它的二级质谱图，给出更详细的结构信息。 本章是在前面优化了的LC操作条件基础上进行LC-MS分析的。以人参为研究对象，对人参中的成分进行定性研究。由于APCI的接口管温度在500℃，以便于流动相的挥发和溶质的电离，但是对人参中可能存在的热不稳定物质，可能会有影响，因此，我们选择ESI做为研究中的接口和离子源。 第一节 实验仪器与方法 一、 仪器与试剂 Waters2690分离单元（包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱恒温系统） Finnigan TSQ三级四极杆质谱仪（包括两级分离四极杆Q1、Q3和CID 部分Q2），祥见图3-1。 Harvad注射泵 索氏提取装置（包括索氏提取器、圆底烧瓶、回流冷凝管、电加热套） TEIDA HPLC级乙腈、异丙醇。 Millipore超纯水 沈阳化学试剂厂分析纯95%乙醇、分析纯正丁醇 三级四极杆质谱仪的示意图如下： 图3-1 TSQ示意图 二、 实验方法和条件 1、 样品的提取 同第二章的提取方法 2、标准溶液的配制 精密称取标准品2mg溶解在10mL80%乙腈/水中，适当超声使其溶解。以此溶液为标准，分别稀释成浓度为40g/mL, 20g/mL, 2g/mL, 200ng/mL, 20ng/mL的标准溶液。 2、 液相色谱分离条件 同第二章中的2.0mm内径色谱柱的分离条件。 4、液质联用的几种方式 如图3-1所示，液相色谱-质谱联用可以有几种不同的联接方式，第一种是经LC分离后流动相带着样品先经过二极管阵列检测器，然后经LC-MS接口进入质谱被分析。因为经过二极管阵列检测器会损失一部分分离效率，所以可以在LC出口后直接进入质谱，这是第二种。第三种是对纯的标准品，直接用注射泵注入质谱中进行分析。 图3-1 LC-MS示意图 5、一级质谱及二级质谱的条件 一级质谱一般用第一级四极杆做通道，加热毛细管温度300℃，毛细管两端电压4.5KV，夹套气70psi，辅助气10单位，倍增器电压1100V。 二级质谱要用到第三级四极杆，一级质谱的条件相同，碰撞气体的压力3mT，补偿电压50V，每1s扫描一次，三级四极杆的扫描范围根据母离子的范围选取。倍增器电压在有一级和二级并存的时候用1100V，单独二级质谱时用1400V。 第二节 结果与讨论 一、 ESI最佳条件的选择 电喷雾（ESI）接口即离子源的工作原理是电喷雾喷口的毛细管末端处加上数千伏的高压，形成一个高电场，液相色谱的流动相带着样品流经高电压毛细管出口时，在夹套气（sheath gas）的吹扫下，迅速挥发形成雾状气溶胶，其中包含很多小液滴，液滴表面会带上电荷，随着液滴中溶剂的挥发，液滴表面逐渐变小，电荷的积聚后产生强烈的库仑排斥，最终样品会从液滴中溅射出来，形成带电荷离子（带一个或多个电荷）。所带电荷的多少决定于样品的性质和电喷雾的条件。 由于不同性质的物质电离的难易程度不同，接口处的各种电性参数和夹套气的气量大小也直接影响某种物质能否带上电荷和带电的难易程度。我们以注射泵直接进样的方式，以人参皂甙Re为例，调节各种影响样品带电的参数，通过离子强度的变化，帮助选出适合人参皂甙类样品的最佳ESI条件。 实验结果如表3-1所示。 表3-1 不同ESI条件下的离子强度变化 实验编号 加热毛细管温度(℃) 喷雾口电压 倍增器电压 注射泵流量 辅助气量 四极杆通道 离子强度 1 250 4.5KV 1000V 3uL/min 30psi 一级 110016 2 300 4.5KV 1000V 3uL/min 30psi 一级 147257 3 350 4.5KV 1000V 3uL/min 30psi 一级 368188 4 250 4.5KV 1000V 3uL/min 20psi 一级 67482 5 300 4.5KV 1000V 3uL/min 10psi 一级 530878 6 300 4.5KV 1000V 3uL/min 30psi 三级 168128 喷雾口的电压选择在仪器的说明书推荐最佳的4.5KV。因为低于或高于4.5KV的3.5KV和5.5KV喷雾口电压都会使离子强度降低。 毛细管的温度是在进样口的位置，它的温度高低会影响物质的带电情况。对热不稳定的物质，温度太高会破坏物质的结构。而温度太低又影响带电的效果。从实验2、4、5 的比较中可以发现，温度升高可以使离子强度升高，但是不可以升得太高，以免破坏进样毛细管周围密封用的塑料箍环，使前级真空泵在空闲的状态时负荷太大，也对分析的结果造成不好的结果。 夹套气的作用是使来自液相色谱的液体中的溶剂挥发，而样品在挥发的过程中带电。夹套气与液体的流量有一定的比例关系，但是对不同的样品可以在一定范围内变化，以得到最大的离子强度。如实验2、5、6的比较中看出，流量3uL/min时，夹套气20psi时离子强度最低。30psi时的离子强度大于20psi时的离子强度。10psi时的离子强度最高属于最适合的范围。 三级四极杆质谱中的第一级和第三级都可以用来作一级质谱的全扫描，第二级是作碰撞诱导裂解的空间。一级质谱与三级质谱虽然工作原理相同，但是两者的离子通道不同，离子强度通常会有一些差别，一般三级四极杆检测到的离子强度会高一些。实验2和3是保持其他条件相同，只是实验2用一级四极杆，实验3用三级四极杆，可以看出用三级四极杆的实验3得到的离子强度略高，但是差别不是很大。 倍增器的电压是与放大倍数直接相关的，倍增器电压越高，得到的离子强度越高，但是样品信号与噪音的信号同时被放大。而且倍增器的电压太高容易使倍增器疲劳，降低仪器的使用寿命，所以倍增器的电压选在1000V-1200V之间。 二、液相色谱的流动相背景对质谱响应的影响 与气相色谱有显著不同的是液相色谱在分析热不稳定和难挥发物质上有独特的优势，但是是以液态的流动相为前提的。在与质谱联用时，GC的气态流动相很容易与样品分离，而LC的液态流动相尽管可以在液质联用接口处使绝大部分流动相分离除去，但流动相背景带来的影响还是不可避免的。 如图3-3a，拟人参皂甙F11的标准对照品在质谱图上出峰时，总离子流图显示出一个“倒峰”。总离子流色谱图是以每一个瞬时采集的质谱图叠加在一起组成的。拟人参皂甙F11出峰时出“倒峰”说明在没有样品流出时的时间内由背景造成的离子流强度高于样品流出时的离子流强度。而由背景引起的离子流强度的质荷比范围一般在300以下。因此，如图3-3b所示，如果选定质谱的质量扫描范围在300m/z以上，就可以在很大程度上克服背景的干扰。但同时也使LC-MS对m/z300以下的浓度较低的物质失去了检测的机会。一般说来，分子量较低的物质比较容易挥发，可以用GC-MS来分析低分子量范围的样品，祢补LC-MS在背景干扰上的不足。 图3-3 背景对标准品拟人参皂甙F11的一级质谱的影响 图3-4 背景对二级质谱的影响 尽管说在m/z300以上背景造成的干扰较少，但是在二级质谱中，还是能够看到背景或杂质带来的影响。如图3-4所示，选择在25.82-29.10min范围内的965.60m/z为母离子，碰撞诱导裂解的办法使其变为碎片，看它的子离子，得到的二级质谱图中有m/z998.3出现，很明显它不是由于目标离子引起的，杂质或背景噪音的存在引起。说明即使在二级质谱中也不要忽略背景和杂质的影响。 三、LC-MS对人参化学成分的初步定性 在第一节所述的实验装置下，从LC直接联接MS，即液质联用的第二种情况。质量范围选择200-1500，每2秒钟采集一个质谱图，这些实时的质谱图迭加在一起得到的基峰图如图3-5所示。可以想象在120分钟内巨大的数据量，可以提供大量的结构信息。但是需要说明的是人参中的组分很多，含量差别很大，还有低分子量范围内本底的影响，使质谱的总离子流色谱图不能象紫外色谱图那样峰的特征明显，但对其仔细分析，从中可以得出许多有用的信息。下面是分析的结果。 1、 有标准品的人参皂甙的定性 人参皂甙的标准品的提取是用柱层析的办法得到的，在提取标准品的过程中尽管用不同极性的溶剂来进行分离提纯，但由于分离效率的影响难免会混进其他组分，因此标准品的紫外色谱图上一般会出几个峰，尤其在样品的浓度较低时更加明显。如图3-6所示，浓度为40g/mL的拟人参皂甙F11在202nm下得到的紫外检测色谱图，由于拟人参皂甙F11的紫外吸收很小，如果单独用色谱上的保留时间来定性会带来一定困难。而在一级质谱图上用分子离子峰来做最后的确认既准确又快捷，如图3-7所示，拟人参皂甙的分子量为800，质谱图中m/z801.9为[M+1]+，很容易对其定性。实际药材的提取液由于存在其他组分的干扰，定性过程中更加显出用质谱的优越性了。 图3-5 人参实际样品分析的基峰图 图3-6 标准品拟人参皂甙F11202nm下的色谱图 图3-7 标准品拟人参皂甙F11的一级质谱图 人参中十种人参皂甙的定性结果列于下表。 表3-2十种人参皂甙的定性结果 名称 分子离子峰 保留范围（min） [M+H]+/[M+Na]+（[M+H2O]+） [M-H]-/[M+H2O]- 人参皂甙Rg1 801.0/818.4 799.4 19.0-19.17 人参皂甙Re 947.6/964.5 945.6/965.6 20.46-20.73 人参皂甙F11 801.8/823.5 / 27.57-27.62 人参皂甙Rb1 1109.6 1107.6 31.53-32.21 人参皂甙Rg2 785.5 783.5 32.25-32.84 人参皂甙Rh1 639.4 637.2 32.84-33.84 人参皂甙Rc 1079.7 1077.7 34.71-35.38 人参皂甙Rb3 1096.8/1101.7 1076.5 35.81-36.39 人参皂甙Rd 947.6/964.5 945.6/965.4 36.71-37.93 人参皂甙Rh2 623.4 621.4/641.3 60.25-60.52 其中值得一提的是拟人参皂甙F11，有文献报道[19]只在西洋参中存在，而人参中没有，因此可以把拟人参皂甙作为区别人参和西洋参的标志。而我们的实验证明尽管人参中拟人参皂甙含量较低，但还是存在的。可见，对检测的灵敏度不高的紫外检测器，质谱具有不可比拟的优势。 2、 没有标准品的人参皂甙的初步定性 在没有标准品的情况下，通常用色谱是不能定性的，尤其是人参皂甙类化合物没有什么特征的紫外吸收，更是如此。人参药材经过前面所述的方法提取以后，经LC-MS得到色谱图和质谱图。一级质谱图能够给出分子离子信息，有时是分子离子与其它离子的加合物，可以通过两个质谱峰的质荷比的差来判断。对已知分子量的化合物，在一级质谱中选择质量范围，得到一个或几个峰，进一步确定分子离子峰的保留范围，与已知化合物符合的质谱峰，做它的二级质谱图，从得到的碎片信息中进行归属，判断是否为该化合物。 （1） 人参皂甙R0的初步定性 人参皂甙R0是齐墩果酸型人参皂甙，它的分子量为956。结构见第一章图。在一级质谱图中选择正离子Mass Range为973-975，负离子选择的Mass Range为955-957，都得到一个峰，保留范围为14.66-15.99 Min。其中正离子m/z 974.5初步归属于[M+18]+和m/z 979.9初步归属于[M+Na]+，负离子m/z 955.4初步归属于[M-H]-。为了进一步确定结构，以m/z 974.5和m/z 955.4为母离子，碰撞诱导裂解的办法做它们的二级质谱，看它们的碎片离子。实验条件如第一节所述。 如图3-8所示的二级质谱图，各峰的归属如下： 以m/z 955.4为母离子时，碎片m/z 455.2为齐墩果酸型皂甙的皂甙元的特征峰，m/z 436.7为[455-H2O]-，m/z 793.2为人参皂甙R0失去末端的一个葡萄糖，[M-glu]- ，m/z 613.5为在分子失去一分子葡萄糖的基础上再失一个葡萄糖，并且断裂的位置是在糖苷键的O以前，即[793.2-glu-O]- ，m/z569.2为m/z 613.5失去CO2，[613- CO2]-。 以m/z 974.5为母离子时，产生的碎片m/z 439.7为齐墩果酸皂甙元失去一分子水，[456-H2O]+，m/z 793.4为人参皂甙R0失去一分子葡萄糖，[M-glu]+，m/z 629.8为在此基础上再失一分子葡萄糖，[M-glu]+。 由上述对二级质谱的推断可知，在14.66-15.09min出峰的化合物与人参皂甙R0结构符合，可以初步定性为人参皂甙R0。 图3-8以m/z955.4和m/z974.5为母离子的二级质谱图 （2） 人参皂甙Rs1 /Rs2的初步定性 人参皂甙Rs1 和Rs2 是乙酰化的Rb2和Rc，它们的分子量相同，同属于人参二醇型皂甙，结构的差别很细微，同Rb2和Rc的差别在于20位的糖苷链末端糖Rs1是阿拉伯吡喃糖，Rs2是阿拉伯呋喃糖，两者在质谱上是不能区分的。 一级质谱正离子的选择Mass Range为1121-1122和1138-1140，负离子的Mass Range为1121-1122。一般情况下负离子的强度低于正离子，负离子的Mass Range没有强峰。正离子的Mass Range有一个重叠峰，保留时间为29.43-30.95Min，质谱图上m/z 1138.6初步归属于[M+18]+。重叠峰有可能是Rs1 和Rs2先后出峰但是没有完全分开的结果。 分别以m/z 1138.6 和m/z 1139.50为母离子，做它们的二级质谱图，其他条件同前。如图3-9所示，m/z 1139.5得到的碎片离子中，m/z 440.2为二醇型人参皂甙元失去一分子水的结果，m/z 1042.2为母离子失去一分子阿拉伯糖并且从O处断开，再失去两分子水，[1139-arap（f）-O-H2O]+。m/z 1138.6得到的碎片中，m/z 987.9为母离子失去一分子阿拉伯糖[1138-arap（f）]+，m/z 784为母离子在此基础上再失去一分子葡萄糖和一分子乙酰基，[1138-arap（f）-Ac-glu]+ 。 由上面的解析可以看出，此化合物与人参皂甙Rs1 和（或）Rs2比较符合，但是只凭质谱的结果不能判断是两者的混合物还是只有其中的一种。只能说初步定性是Rs1 和（或）Rs2。 图3-9以m/z1138.6和m/z1139.5为母离子的二级质谱图 图3-10 以m/z1150.4为母离子的二级质谱图 （3） 西洋参皂甙R1的初步定性 西洋参与人参同属五加科植物，西洋参皂甙R1在西洋参中含量较高故得名。已知西洋参皂甙R1的分子量为1151，属于人参二醇型皂甙。一级质谱的正离子选择的Mass Range为1151-1153和1174-1176。负离子选择的Mass Range为1151-1153。负离子Mass Range图上的一个宽峰，12.87-18.21Min可以排除，因为看不到分子离子峰。正离子的Mass Range有两个峰，其中86.22-87.99Min同样是因为看不到分子离子峰也可以排除。所以西洋参皂甙R1可能在29.58-31.45Min内，m/z 1150.4可以初步认为是[M+H]+。 以m/z 1150.4为母离子，做它的二级质谱图，得到的结果如图3-10所示，其中，m/z459.0为二醇型人参皂甙的皂甙元特征峰，m/z 482为皂甙元加上一分子水。m/z 916为母离子失去一分子-O-葡萄糖和一分子丙二酰，[1150-Aa-O-glu]+， m/z 701为母离子失去一分子丙二酰和一个由两个葡萄糖加合的糖链，再失两分子水，[1150-Aa-（glu-glu）-2H2O]+。由碎片的m/z可以看出与西洋参皂甙R1的结构符合得较好，可以初步定性为西洋参皂甙R1。 （4） 人参皂甙MRb1的初步定性 已知MRb1的分子量为1196，属于二醇型人参皂甙。一级质谱正离子的Mass Range选择1212-1214，负离子Mass Range选择1194-1197，两者都在15.72-16.06Min之间出现一个大峰，它们的质谱图上，m/z 1194.1初步归属于[M-H]-，m/z 1213.2初步归属于[M+18]+。 以m/z 1213.2和m/z 1194.1为母离子，二级质谱图如图3-11所示。 图3-11以m/z1194.1和m/z1213.2为母离子的二级质谱图 以m/z 1213.2为母离子得到的碎片中，m/z 1048.2为母离子失去一分子葡萄糖，[M-glu]+，m/z 948.5为母离子在此基础上再失一分子丙二酰，[M-glu-Aa]+，m/z 545.5为二醇皂甙元加一分子丙二酰。 以m/z 1194.1为母离子得到的碎片中较少，只有m/z 945.3，m/z 945.3为母离子失去一分子葡萄糖和一分子丙二酰，[M-glu-Aa]-。 由碎片的信息可以看出，该化合物与人参皂甙MRb1的结构比较符合，可以初步定性为人参皂甙MRb1。 （5） 人参皂甙MRd的初步定性 已知人参皂甙MRd的分子量为1033。属于人参二醇型皂甙。一级质谱正离子选择的Mass Range 为1032-1034，负离子选择的Mass Range为1032-1034。正离子Mass Range的峰有两个大峰，但是它们的分子离子峰与MRd不符，可以排除。负离子的Mass Range有一个峰，保留时间是18.01-19.48Min，m/z 1032.2初步归属于[M-H]-。 图3-12以m/z1032.2为母离子的二级质谱图 以m/z 1032.2为母离子，做二级质谱图看它的子离子，得到的二级质谱图如图3-12所示。其中，m/z 784为母离子失去一分子葡萄糖和一分子丙二酰，[M-glu-Aa]+，m/z 766.4为上述的离子再失去一分子水，[784-H2O]+，m/z 621为m/z 766.4失去一分子葡萄糖，[784-glu]+，m/z 603.5为m/z 621失去一分子水。 由上面的分析初步可以认定该时间范围内出峰的是人参皂甙MRd。 （6）三七人参皂甙R1的初步定性 三七人参皂甙R1在人参三七中含量较高，故得名，由于人参与人参三七同属五加科植物，因此可能含有相同的成分。已知三七人参皂甙R1的分子量为933，属于三醇型人参皂甙。一级质谱的正离子的选择质量范围是933-935，负离子选择的质量范围是932-934。 正离子的Mass Range图上，有三个峰，其中80.48-83.26Min可以排除，因为看不到分子离子峰。正离子的Mass Range的7.85-10.60Min的m/z 933.4，还有一个在32.72-32.82Min的m/z 934.4。 分别以m/z 933.4和 m/z 934.4为母离子，看它们的二级质谱图，如图3-13所示，m/z 934.4为母离子得到的二级质谱图上的碎片结果与三七人参皂甙R1不能符和，不能确认为三七人参皂甙R1。m/z 933.4为母离子得到的二级质谱图上的碎片中，m/z 765.2为母离子失去一分子木糖和一分子水，[M-xyl-H2O]+，m/z 638.2为母离子失去木糖与葡萄糖的糖链，[M-（glu-xyl）]+，m/z 657.7为m/z 638.2加一分子水，m/z 605.3为[M-O-（glu-xyl）]+。 由以上的分析可以看出与三七人参皂甙R1的结构符合较好，初步定性为与三七人参皂甙R1。 图3-13以m/z934.4和m/z933.4为母离子的二级质谱图 （7）、人参皂甙Rb2的初步定性 人参皂甙Rb2、Rb3 和Rc的分子量相同，其中Rb2和Rb3的结构还非常相似。三者同属人参二醇型皂甙，在质谱上是不能区别的。 一级质谱的正离子的选择Mass Range为1077-1079和1100-1102，负离子的选择Mass Range为1077-1079和1094-198。负离子的Mass Range有两个峰，32.77-33.46Min和36.71-37.00Min。36.71-37.00Min质谱图上m/z 1077.2归属于[M-H]-。正离子的Mass Range有一个峰，31.45-31.84Min，质谱图上m/z 1079.0归属于[M+H]+。由于已经确定了人参皂甙Rb3 和Rc的出峰时间，在这三者中，文献报道[21,22]的相似条件下出峰顺序为Rc在Rb2的前面出峰，可以排除两者的情况下，初步认为人参皂甙Rb2的出峰范围是36.71-37.00Min。由于人参皂甙Rb2的含量较少，如图3-14人参皂甙Rb2的一级质谱图所示，因此得不到它的二级质谱图，得不到结构的进一步信息，只能初步猜测。 图3-14实际样品中人参皂甙Rb2的一级质谱图 （8） 人参皂甙Rg3 /F2的初步定性 人参皂甙Rg3 和F2属于同种类型的二醇型人参皂甙，分子量相同，都为784。 一级质谱的正离子的选择Mass Range为784-786和806-808，负离子的选择Mass Range为783-785。负离子的Mass Range没有明显的峰。正离子的Mass Range有二个峰，排除已经确定的人参皂甙Rg2，可能的保留时间为39.32-40.31Min。质谱图上m/z 785.3初步归属于 [M+H]+，m/z 802.4初步归属于[M+18]+。 图3-15以m/z785.1为母离子的二级质谱图 分别以m/z 785.3和 m/z 802.4为母离子，做它们的二级质谱图看它们的子离子，结果如图3-15所示，m/z 802.4的子离子与人参皂甙Rg3 或F2的结构都不能符合，说明原先的单以分子离子峰进行的归属不正确。以m/z 785.3得到的碎片中，m/z 747.5为母离子失去二分子水，m/z 645.8为母离子失去一分子葡萄糖并和钠结合的结果，[M-glu+Na]+，m/z 457.7为人参二醇型皂甙元的特征峰，m/z 476.5为皂甙元与一分子水加合，而m/z 439.9为皂甙元失去一分子水。 由于人参皂甙Rg3 和F2的结构相同，分子量也相同，上述碎片的结构与两者有相符，因此质谱图不能区别它们，在此保留单位内出峰的可能是两者的混合，也可能是其中的一种。 （9） 人参皂甙Rf 的初步定性 人参皂甙Rf的分子量为801，属于三醇型人参皂甙。一级质谱的正离子的选择Mass Range为800-802和823-825。负离子的选择Mass Range为799-801和816-820。负离子的Mass Range在47.80-48.39有一个峰，质谱图中有817.2和833.3出现，不是Rf的分子离子峰或者离子加和物，可以排除Rf的可能。正离子的Mass Range在13-15min有一个峰，m/z 818.3可能是[M+H2O]+。负离子的Mass Range在49-52min时间范围内质谱图有m/z 819.3可能是[M-H]-。 图3-16 以m/z819.5为母离子的二级质谱图 分别以m/z 818.3 和m/z 819.3为母离子，看它们的子离子，得到的结果如图3-16所示，以m/z 818.3为母离子得到的碎片与人参皂甙Rf 的结构不符。以m/z 819.3为母离子得到的碎片中，m/z 657.3为母离子失去一分子葡萄糖，[M-glu]+，m/z621.1为母离子在此基础上再失去一分子水和一个O，[M-O-glu-H2O]+，不能看到与皂甙元相关的碎片。从以上的解析可以看出与人参皂甙Rf 的结构比较符合，可以初步定性为人参皂甙Rf 。 （10） 人参皂甙MRb2 /MRc的初步定性 MRb2 和MRc是丙二酰化的Rb2和Rc。Rb2和Rc的分子量相同，同属于人参二醇型人参皂甙。结构上的差别在于20位的糖苷链末端糖Rb2是阿拉伯吡喃糖，Rc是阿拉伯呋喃糖。它们在色谱上的保留时间不同，而质谱是不能区别两者的。 正离子的选择质量范围是1164-1166，负离子的选择质量范围是1164-1166。正离子的Mass Range有两组峰，其中14.76-18.55Min与负离子的Mass Range的唯一峰相对应。正离子质谱图中m/z 1164.5可能是[M+H]+ ，m/z 1182.5可能是[M+18]+。负离子质谱图中m/z 1163.3可能是[M-H]-。因此，MRb2 /MRc有可能在14.76-18.55Min和32.13-32.92Min范围内。 分别以m/z1165.6和 m/z 1163.3为母离子，做它们的二级质谱图，得到的结果如图3-17所示。m/z 165.6为母离子得到的二级质谱图不能提供证明为人参皂甙MRb2 或MRc的碎片。m/z 1163.3为母离子得到的碎片中，m/z 1077.9为母离子失去一分子丙二酰，[M-Aa]-，m/z363.0为糖链的碎片，[glu+arap（f）+Aa-H2O]-。 由于碎片能够提供的信息不多，只能初步定性在此范围出峰的是人参皂甙MRb2 或MRc。可能是其中的一种，也可能是两者的重叠。 图3-17以m/z1163.3和m/z1165.6为母离子的二级质谱图 （11）人参皂甙Ra1 /Ra2的初步定性 人参皂甙Ra1 /Ra2的分子量相同，同属二醇型人参皂甙。它们结构差别也很细微，只是在20位连接的糖苷链的中间一个糖不同，Ra1为阿拉伯吡喃糖，Ra2为阿拉伯呋喃糖。质谱上对两者是不能区分的。一级质谱的正离子的选择Mass Range为1210-1212，负离子的选择Mass Range为1210-1212。负离子的Mass Range没有明显的分子离子峰，对定性没有帮助。正离子的Mass Range有三个峰，其中保留范围在87.10-90.84Min的峰可以排除，因为质谱图中m/z 1209.7是1189.9+18，m/z 1211.7是1193.8+18，有可能是分子量为1188或1193的重叠峰。另外两个m/z 1211.2的峰在19.83-22.27 Min和28.90-31.45 Min有可能是分别为Ra1 和Ra2或者是两者的重叠峰。 分别选择20-21min内的m/z 1211.2和28-31min内的m/z 1211.2为母离子看它们的二级质谱图，得到的结果如图3-18所示。28-31min内的m/z 1211.2为母离子得到的碎片信息与人参皂甙Ra1 /Ra2的结构不符。20-21min内的m/z 1211.2为母离子得到的碎片中，m/z 458.9为二醇型人参皂甙的皂甙元特征峰。m/z 905.6为母离子失去两个葡萄糖的糖链并与一分子水加合的结果，[M-（glu-glu）+H2O]+。m/z 930.9为母离子失去一个阿拉伯糖和木糖的糖链的结果，[M-O-（arap（f）-xyl）]+。 由以上的分析可知，在20-21min内出峰的可能是人参皂甙Ra1 和Ra2的其中一种，或者是两者的叠加。 图3-18以不同保留时间的m/z1211.2为母离子的二级质谱图 （12） 三棕榈酸甘油脂的初步定性 三棕榈酸甘油脂的分子量为803。正离子的选择Mass Range为803-805，只有一个强峰出现，时间是87.50-89.37min，质谱图上m/z 803.3可能是[M+H]+。 负离子的选择Mass Range为803-805，没有强峰，45.87-47.74Min出现的较弱峰可以判断不是三棕榈酸甘油脂。因此三棕榈酸甘油脂可能出现在87.50-89.37min。 以m/z 803.3为母离子，看它的二级质谱图，得到的结果如图3-19所示，其中m/z 238.8是棕榈酸的特征峰，m/z 477.3为二个单位的棕榈酸，质谱图上出现的其他质荷比有可能是杂质或者背景的干扰，所以只能初步认为86-88min内可能为三棕榈酸甘油脂。 图3-19以m/z803.4为母离子的二级质谱图 （13） 黄酮类化合物山柰酚的初步定性 山柰酚属于黄酮类化合物，分子量为286。 正离子的选择Mass Range为285-288，出现三个较大峰，分别是20.71-21.39min，68.03-69.81min，79.79-80.48min。20.71-21.39min质谱图上m/z 285.7与山柰酚的分子量不符，基本可以排除，79.79-80.48min的质谱图上m/z 284.8也不符合，排除掉。比较满足的就是68.03-69.81min的峰，m/z 287.8可能是[M+H]+。 负离子的选择Mass Range为285-287，在68.03-69.81min没有明显的分之离子峰，对定性没有帮助。 以m/z 287.8为母离子，做它的二级质谱图，得到的结果如图3-20所示， m/z 269.5为母离子失去羟基，[M-OH]+，m/z 252.0为m/z 269.5再失去羟基，[269.5-OH]+，m/z为母离子失去苯酚，[M-C6H5O]+。 与文献上报道的EI-MS的碎片不同，可能因为两种使分子碎裂的方式不同，从二级质谱上初步判断是山柰酚。 图3-20以m/z287.8为母离子的二级质谱图 （14） 人参黄酮甙的初步定性 人参黄酮甙也属于黄酮类化合物，分子量为610。 正离子的选择Mass Range为610-612，有两个较强峰，分别为73.07-73.96min和84.34-84.94min。质谱图上m/z 611.2可能是[M+H]+，m/z 628.0可能是[M+H2O]+。 负离子的选择Mass Range为610-612，有三个较强峰，分别为68.17-68.87min 74.21-75.00min，76.28-77.27min， 因此人参黄酮甙可能的范围是68.17-68.87min 73.07--77.27min和84.34-84.94min。 分别以m/z 610.9 和m/z 628.0为母离子做它们的二级质谱图得到的结果如图3-21所示，其中，以m/z 610.9为母离子得到的碎片中，m/z447.9为母离子失去一分子末端葡萄糖，[M-glu]-，m/z 269为人参黄酮甙的母体山柰酚失去一分子水。以m/z 628.0为母离子得到的碎片中，m/z 465.6为母离子失去一分子末端葡萄糖，[M-glu]+，m/z285.1与山奈酚不符。可见，在84.34-84.94min内出峰的化合物尽管不是人参黄酮甙，但是有可能是末端为葡萄糖的化合物。对人参黄酮甙的出步定性认为在68.17-68.87min比较符合。 图3-21以m/z610.9和m/z628.0为母离子的二级质谱图 （15） 菜油甾醇 菜油甾醇的分子量为400。正离子选择质量范围是399-401，负离子选择质量范围在399-401。两者都在76.78-77.22min出峰，正离子质谱图上m/z 400.6可能是[M+H]+，负离子的质谱图上离子强度较小，没有明显的分子离子峰，被淹没在背景的燥声中了。因此，菜油甾醇可能的范围是76.78-77.22min。 由于菜油甾醇的含量较少，所以得不到它的二级质谱图，因此只是对它可能存在的一种推测，没有得到进一步的证实。 二、 人参皂甙的一级质谱及二级质谱的规律 1、 一级质谱的规律 从九种人参皂甙标准品的一级质谱中总结出的规律，九种人参皂甙中既有二醇型人参皂甙，也有三醇型人参皂甙。一级质谱可以用ESI也可以用APCI来做为接口和离子源得到，两者的差别不大。由于APCI的加热套管的温度为500℃，对人参中可能存在的热不稳定物质会有影响，所以选择ESI接口，下面的二级质谱结果同样是在ESI接口下做出的。 （1）一级质谱图中都会有分子离子峰出现，但分子离子峰不一定是最强的基峰。正离子的一级质谱分子离子峰为[M+1]+，质谱图上得到的m/z为M+1。负离子的一级质谱的分子离子峰为[M-1]-，质谱图上得到的m/z为M-1。 （2）正离子的一级质谱图中除了分子离子峰外，一般还会出现[M+Na]+、[M+K]+、[M+H2O]+等加合离子的峰。加合离子的峰可以通过与分子离子峰比较得出。有时加合离子的峰强度要高出分子离子峰，甚至高出几倍。 对生长在自然环境中的天然中草药来说，其中有钠钾离子或水的加合是不难理解的，这对用质谱分析中药的成分也是值得注意的一点。 （3）负离子的一级质谱图一般以分子离子峰[M-H]-为基峰，（当然要把溶剂的干扰排除在外）适合用来识别该化合物的分子量。但负离子的峰强度往往低于正离子的峰强度，对含量较少的样品信号与背景的噪音不能区别。 负离子的一级质谱图上也会有[M+H2O]-、[M+CH3CN]-加合物峰，强度有时也会比分子离子峰高，通过与分子离子峰比较可以知道是否为加合物峰。 2、 九种人参皂甙的二级质谱及解析 人参皂甙的二级质谱是九种人参皂甙一级质谱的基础上得到的。二级质谱的实验条件如第一节所示。九种人参皂甙的二级质谱的质谱图及相应的解析见图3-22至图3-30及说明。 （1）人参皂甙Rb1的二级质谱 图3-22 人参皂甙Rb1的二级质谱图 图3-22中的正离子以1131.6为母离子，得到的上面的碎片中，m/z 949.7为母离子失去一分子末端葡萄糖和一分子水，[M-glu-H2O]+，m/z 789.7为母离子失去一个由双糖组成的糖链和一分子水，[M-（glu-glu）-H2O]+。负离子以m/z 1107.6为母离子，得到m/z 945.0为母离子失去一分子末端葡萄糖，[M-glu]-，m/z 783.0为母离子失去两分子的末端葡萄糖，或者说在前面的基础上再失一分子葡萄糖，[M-glu-glu]-，m/z 621.4和m/z 477.6为依次再失去非末端的葡萄糖，后者还结合一分子水。 （1） 人参皂甙Rc的二级质谱图如图3-23所示 图3-23 人参皂甙Rc的二级质谱图 图3-23人参皂甙Rc的二级质谱图 图3-23的正离子以m/z 1101.6为母离子，二级质谱的碎片中，m/z789.1母离子失去末端的阿拉伯呋喃糖和末端的葡萄糖，[M-glu-araf]+，m/z 334.7为[glu+araf+Na]+。负离子分别以三种离子为母离子，以m/z 1078.0为母离子时，得到的碎片中，m/z 913.1为母离子失去一分子葡萄糖，[M-glu]-。以m/z 1113.7为母离子时，得到的碎片中m/z 836.9为母离子失去一分子葡萄糖和一分子阿拉伯呋喃糖，并与水加合的结果，[M-glu-araf+2H2O]-。以m/z 1167.8为母离子时，碎片m/z 1078.7为母离子失去一分子葡萄糖并失三分子水，[M-glu-3H2O]-，m/z 819.1为[1078-glu-araf+3H2O]-，m/z 311.3为glu+araf。 （3）人参皂甙Rg2的二级质谱图如图3-24所示， 图3-24人参皂甙Rg2的二级质谱图 上图中正离子以m/z 807.5为母离子，碎片中m/z 661.6为母离子失去一个末端鼠李糖，断裂的位置是在-O与鼠李糖之间，[M-147]+，m/z 481.4为三醇皂甙元失水加钠的结果。负离子以m/z 783.5为母离子，得到碎片m/z637.2为母离子如正离子失去鼠李糖的方式相同失去一分子鼠李糖，[M-147]-，m/z 474.8为三醇皂甙元的特征峰。 （4）人参皂甙Rg1的二级质谱图如图3-25所示， 图3-25中正离子以m/z 823.5为母离子，得到碎片中m/z643.3为母离子事情一分子末端葡萄糖和一分子水，[M-glu-H2O]+。负离子以m/z 799.6为母离子，得到的碎片中m/z 637.3为母离子失去一分子末端葡萄糖，[M-glu]-，m/z 618.7为m/z 637.3失去一分子水，m/z 475.2为三醇型人参皂甙元的特征峰。 图3-25人参皂甙Rg1的二级质谱图 （5）人参皂甙Rb3的二级质谱图如图3-26所示， 正离子以m/z 1101.6为母离子，得到的二级质谱图中，碎片m/z 789.5为母离子失去一分子葡萄糖和一分子木糖，[M-glu-xyl]+，m/z 465.1为m/z 789.5失去两分子葡萄糖。 负离子分别以m/z 1077.8和m/z 1113.8为母离子，以m/z 1077.8为母离子得到碎片中m/z 915.6为m/z 1077.8失去一分子葡萄糖，[M-glu]-，m/z 783.4为m/z 915.6再失一分子木糖加合一个水分子，[915.6-xyl+H2O]-，m/z 621.2为m/z 783.4再失一分子葡萄糖，[783.4-glu]-。 以m/z 1113.8为母离子得到的碎片中，m/z 983.1为母离子失去一分子木糖并与一分子水加合，[M-xyl+H2O]-，m/z 783.7为母离子失去一分子葡萄糖和一分子木糖，再失一分子水，[M-xyl-glu+H2O]-。 图3-26人参皂甙Rb3的二级质谱图 （6）人参皂甙Rh1的二级质谱图如图3-27所示。 正离子以m/z 661.4为母离子，得到的碎片中m/z 480.9为母离子失去一分子葡萄糖和一分子水，[M-glu-H2O]+。 负离子以m/z637.5为母离子，得到的碎片中m/z618.5为母离子失去一分子水，m/z 475.2为三醇型人参皂甙元的特征峰。 图3-27 人参皂甙Rh1的二级质谱 （7） 人参皂甙Rd的二级质谱图如图3-28所示。 正离子以m/z 964.5为母离子，得到的二级质谱图中，碎片m/z 599.7为母离子失去两分子末端葡萄糖和两分子水，[M-2glu-2H2O]+，m/z 325.1为一个糖链，由两分子葡萄糖组成。 负离子以m/z 946.0为母离子，得到的m/z 783.4为母离子失去一分子末端葡萄糖，[M-glu]-，m/z 621.7为母离子失去两分子葡萄糖，[M-2glu]-。 （8） 人参皂甙Re的二级质谱图如图3-28所示。 正离子以m/z 969.5为母离子，得到的二级质谱图如3-28所示。以m/z969.5为母离子得到的碎片中，m/z 789.5为母离子失去一分子葡萄糖和一分子水，[M-glu-H2O]+，m/z 662.2为母离子事情两分子葡萄糖并与一分子水加合的结果[M-2glu+H2O]+。负离子以m/z 945.5为母离子，得到的碎片中，m/z 783.1为母离子失去一分子葡萄糖，m/z 799.7为m/z 783.1加合一分子水。 图3-28 人参皂甙Rd的二级质谱图 图3-29 人参皂甙Re的二级质谱图 图3-30 人参皂甙Rh2的二级质谱图 （9）人参皂甙Rh2的二级质谱图如图3-30所示。 正离子以m/z 686.5为母离子，得到的碎片结果中，m/z 为人参皂甙Rh2加上一个钠，说明m/z 686.5是人参皂甙Rh2的溶剂化物。 负离子以m/z 621.4为母离子，得到m/z459.6为母离子失去一分子葡萄糖的结果，[M-glu]-。 3、人参皂甙二级质谱的规律 人参皂甙的二级质谱是九种人参皂甙一级质谱的基础上得到的。从中总结出人参皂甙二级质谱的一般规律。二级质谱的实验条件如第一节所示。九种人参皂甙的二级质谱的质谱图及相应的解析见图3-21至图3-29及说明。 （1） 人参皂甙的二级质谱得到的碎片数目不同，即使选择相同的碰撞气体压力和碰撞补偿电压也不能使所有皂甙的碎片量相同。说明尽管有些人参皂甙的结构很相似，但是其中的细微差别影响它们碎裂的方式和几率。有些人参皂甙比较稳定，不易产生碎片。 （2） 如果以加合离子如[M+Na]+、[M+K]+、[M+H2O]+等为母离子，它们的子离子中出现M的机会不同，有些离子加合物直接失去糖碎片而不是丢掉加合离子，这可能与不同人参皂甙的结构有关。 （3） 人参皂甙糖苷链的末端糖比较容易断裂下来。对由两个以上的糖组成的糖苷链，越接近皂甙元的糖断裂的机会越小，因此皂甙元的峰强度一般很低，浓度低的人参皂甙甚至看不到皂甙元的特征峰。 （4） 不同类型的人参皂甙的二级质谱图中一般会有皂甙元的特征峰出现，但有时它们的强度很低，或者会进一步失水，从m/z上能够进行归属。 三、 LC-MS对人参皂甙进行定量 与色谱法相似，质谱可以用外标法和内标法对组分进行定量。由于内标法要筛选化合物，满足内标的要求，所以我们选择更简便的外标法定量，以说明质谱的定量功能。 标准溶液的配制如第一节所述。采用直接进样的方式测标准样品在质谱中的响应值即离子强度。实际样品测得的响应值在工作曲线上插入得到实际样品的浓度，实现定量。 1、 九种人参皂甙的标准工作曲线 表3-3 质谱检测的九种人参皂甙的标准工作曲线 名称 线性范围 线性方程 相关系数 人参皂甙Rd 20ng/mL-21*104ng/mL Y=1340.6+0.319x 0.991 人参皂甙Rh2 20ng/mL-22*104ng/mL Y=3826.7+4.05x 0.9998 人参皂甙Re 20ng/mL-20*103ng/mL Y=7386+11.18x 0.9978 人参皂甙Rg1 20ng/mL-40*103ng/mL Y=3281.9+1.80x 0.9989 人参皂甙Rb1 20ng/mL-40*103ng/mL Y=10600+3.11x 0.979 人参皂甙Rb3 20ng/mL-40*103ng/mL Y=6057.7+2.75x 0.991 人参皂甙Rh1 20ng/mL-40*103ng/mL Y=7826+1.90x 0.990 人参皂甙Rg2 20ng/mL-40*103ng/mL Y=7628+3.08x 0.9870 人参皂甙Rc 20ng/mL-40*103ng/mL Y=3845.7+1.53x 0.991 从上面的线性范围可以看出，用质谱进行定量的线性范围宽，而且最低限明显低于紫外检测的最低限，可以检测更加微量的样品，这是质谱定量的优势。 2、 人参皂甙含量的测定结果 表3-4 质谱测定的人参皂甙定量结果 名称 响应值 含量（微克/克） 人参皂甙Rd 12889 72.4 人参皂甙Rh2 19043 5.51 人参皂甙Rg1 122978 132.6 人参皂甙Rb3 12202 4.47 人参皂甙Rc 21405 23.01 人参皂甙Rh1 15559 8.10 对在表中未列出的人参皂甙，因为含量太低或者是因为分离不好而使峰扩散，无法计算峰面积，因此未给出含量。与表2-6的紫外检测的定量结果比较，两者结果比较吻合，说明定量的结果比较可靠。 小结 对中药这样一个复杂的体系，如何能够将其中的组分分离并给出定性的信息是目前中药现代化研究中的重点和难点问题。本章是在前面一章已经建立起来的分离条件的基础上，用液相色谱-质谱联用的方法对中药人参中的化学物质基础进行研究的，力图通过质谱的定性手段实现人参中组分的分离和定性同时完成。 本章对质谱在分析人参皂甙类化合物时的不同条件进行了考察，得到了最佳的实验条件，同时也指出液相色谱的流动相对样品的分析带来的影响是不能忽视的，这也是与GC-MS显著不同之处。 质谱对已有标准品的人参皂甙的定性比用色谱保留时间定性有更加准确、快捷的特点，尤其对大部分中药的标准品纯度不高的情况下，更是如此。 对十五种没有标准品的组分进行了初步定性。方法是先用选择质量范围得到一个可能存在的范围，对可能的分子离子峰，以它为母离子，做它的二级质谱图，从得到的碎片来推断化合物的结构，得到化合物的初步定性结果。 对不能确定的化合物，可以通过二级质谱的方法来推断结构，这也是质谱的强大定性功能的具体体现。 质谱不仅可以实现定性，还可以定量，外标法定量的线性范围比紫外检测的线性范围宽，最低检测限更低，可以检测很微量的样品。 参考文献 1季欧，质谱分析法，原子能出版社，1978年，北京 2伍越寰，有机结构分析，中国科学技术大学出版社，1993年，合肥 3宋凤瑞等，系列人参皂甙的快原子轰击质谱研究，分析化学，1991，19（2），146-150 4杨松成，生物医药学中的液相色谱-质谱联用，现代有机质谱技术及应用，中国人民公安大学出版社，1999年，北京，5-11 5Waters公司液质联用应用专集，1998年4月，北京 6邸欣等，电喷雾质谱法的理论与实践，沈阳药科大学学报，1999，2，146-150 7杨树民，大气压电离液质联机的应用，质谱学报，1998，1，66-80 8蒋可，有机质谱的今天和明天，现代有机质谱技术及应用，中国人民公安大学出版社，1999年，北京，9-14 9孙允秀等，吉林人参挥发性成分的分析，科学通报，1983，7，514-520 10张惠祥，吉林人参挥发性成分的分析，科学通报，1984，18，1111-1114 11陈英杰，人参挥发油的研究，中药通报，1982，4，29-31 12李向高等，吉林红参与高丽红参的比较研究——挥发油的分析，中成药研究，1985，12，29-30 13唐刚等，中药复方“芩暴止咳颗粒”中柴胡皂甙类成分的液相色谱/质谱联用分析，现代有机质谱技术及应用，中国人民公安大学出版社，1999年，北京，147-148 14刘国文等，高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定清开灵复方中胆酸，现代有机质谱技术及应用，中国人民公安大学出版社，1999年，北京，192-193 15周雨等，电喷雾串联质谱快速分析人参皂甙混合物，化学通报，1998，2，37-40 16Richard B.van Breemen etal. Electrospray Liquid Chromatography/Mass Spectrometry of Ginsenosides. Anal Chem 1995，67，3985-3989 17Xiaomin Wang etal. Determination of Ginsenosides in Plant Extracts from Panax ginseng and Panax quinquefolius L.by LC/MS/MS. Anal Chem 1999，71，1579-1584 18Dirk C.van Setten. Multiple-Stage Tandem Mass Spectrometry for Structural Characterization of Saponins. Anal Chem 1998，70，4401-4409 19李义侠等，假人参皂甙24（R）-F11鉴别人参与西洋参的显著标志，中草药，1995，10，540-541 20陈能煜等，糖甙FAB-MS应用技术研究，现代有机质谱技术及应用，中国人民公安大学出版社，1999年，北京，86-90 21William A.court etal J Chrom A,755(1996)11-17 22Hiedeko Kanazawa etal J Chrom 507(1990)327-332