用液相色谱-质谱联用法测定滨蒿中的茵陈色原酮

摘　要：以薄层色谱、高效液相色谱、三维高效液相色谱对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离分析，采用液相色谱-质谱联用仪、电喷雾离子阱质谱对其结构进行鉴定．结果表明：滨蒿中的利胆有效成分除含有绿原酸、对羟基苯乙酮、 6,7-二甲氧基香豆素外，还首次分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮.

　　茵陈自古以来是中医治疗各种肝胆疾病的要药〔1～3〕．近几年，现代药理研究又进一步阐明茵陈其保肝、利胆和护胰机理，此外尚发现其调血脂、降血压、抗肿瘤和抗病毒性反应等新的药理作用〔4～5〕,使得茵陈活性成分的追踪越来越引起人们的重视．《中国药典》1995版规定茵陈的植物基源有两种：滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kitag.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.，并有大量文献报道其主要有效成分为绿原酸（chlorogenic acid）、6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethylesculetin，DE)、对羟基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone)〔6～8〕．1976年，日本学者小宫威弥等人从茵陈蒿中分离出保肝活性比6,7-二甲氧基香豆素更强的物质茵陈色原酮(capillarisin，CAP)〔9〕，滨蒿中是否含有，至今未见报道．作者对沈阳郊区野生滨蒿，分别采用薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、三维高效液相色谱对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离分析，用离子阱质谱(ESI/MS)对待测物准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级全扫描质谱测定．首次从滨蒿中分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮．
1　仪器与试药
　　日本岛津LC-10AD高效液相色谱仪；SPD-M10A二极管阵列检测器；CLASS-10A色谱工作站；美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，ESI（电喷雾电离）源及LCQ数据处理系统.甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）.标准品：6,7-二甲氧基香豆素和茵陈色原酮由中国中医研究院提供．对照品：对羟基苯乙酮由本校有机教研室提供．药材：采自沈阳郊区，经本校中药鉴定室许春泉老师鉴定为滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kitag.
2　方法与结果
2.1　样品制备
　　精密称取干燥、恒重样品5 g，分别用10倍、8倍、6倍量的水煎煮2、1.5、1 h．合并煎液，减压浓缩至20 mL，转移至125 mL分液漏斗中，用氯仿萃取3次(每次20 mL)，合并氯仿液，减压回收氯仿，残渣用甲醇溶解，定量转移至10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混匀，作为待测液．
2.2　TLC法
　　滨蒿待测液中CAP的TLC分析条件见表1.
Tab.1　Analytical conditions of capillarisin in Artemisia scoparia by TLC

Solid phase　　　Developing agentStandardColor-developing agentRf value
Silica Gbenzene-methanol-water(35∶5∶5)CAPFeCl30.63
Silica Gtoluene-ethylformate-formic acid (7∶3∶1)CAPFeCl30.50
Polyamide filmwater-ethanol-acetylacetone(4∶2∶1)CAPFeCl30.23

　　实验结果表明，样品在与对照品相应的位置上显相同的灰色斑点．
2.3　HPLC法
　　HPLC分析条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱（200 mm×4.6 mm I.D，粒径：5 μm）；流动相：乙腈-水(V∶V=20∶80～90∶10）；梯度洗脱〔10〕，洗脱时间：80 min；流速：1 mL／min；柱温：40℃．
　　结果：将上述待测液注入液相色谱仪中，HPLC图谱及三维HPLC图谱见图1～3.

Fig.1　HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6，7-Dimethylescu-letin;C—Capillarisin

Fig.2　HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6,7-Dimethylescu-letin;C—Capillarisin


Fig.3　3D-HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6,7-Dimethylesculetin;C—Capillarisin
2.4　HPLC-MSn法
　　HPLC-MSn分析条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱（200 mm×4.6 mm I.D，粒径：5 μm）；流动相：甲醇；流速：0.5 mL／min；柱温：20℃；进样量：20　μL；质谱参数设置：离子源喷射电压4.25 kV；毛细管温度：180℃；毛细管电压30 V；鞘气（N2）流速0.75 L／min；辅助气流速0.15 L／min．
　　结果：以ESI为离子源采用正离子方式检测，测得标准品准分子离子峰［M+H］+m/z 317.4，然后同时选择m/z　317.4准分子离子峰进行二级全扫描质谱（full scan MS2）分析，并选择m/z　317.4→302.1进行三级全扫描质谱（full scan MS3）分析．获得标准品和待测物相应的子离子质谱图．测定结果见图4～6. CAP的(+)ESI-MS2、ESI-MS3的碎片主要断裂过程见图7.

Fig.4　TIC chromatogram of capillarisin
A—Standard;B—Sample

Fig.5　Full scan MS2 spectra of capillarisin
A—Standard;B—Sample

Fig.6　Full scan MS3 spectra of capillarisin
A—Standard;B—Sample

Fig.7　The main proposed fragmentation process for capillarisin 
3　讨论
　　a．HPLC测定中发现保留时间为22.82 min的色谱峰和CAP的色谱峰部分重叠．经ESI/MS检测，其准分子离子峰m/z也为317.4，但选择离子MS2、MS3子离子质谱图与CAP的明显不同．其结构鉴定有待于进一步研究．
　　b．对滨蒿水煎煮液有效成分提取的工艺筛选中，曾用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇4种不同极性的溶剂分别萃取．经HPLC跟踪监测，氯仿两次萃取液中有效成分含量已占90%以上，故选用水煎煮后氯仿萃取．该法与甲醇超声法比较，干扰物质少．
　　c．据文献报道〔6〕，在8月下旬至10月中旬采割的茵陈中CAP的含量较高，作者所用样品只是对一个地区、选了二次采割时间（8月20日、8月27日）.经HPLC初步测得6,7-二甲氧基香豆素约0.5%，对羟基苯乙酮约0.09%.
致谢　HPLC-MS质谱图由本室李雪庆、陈笑艳测试，对羟基苯乙酮由有机教研室胡春老师提供，本文承许春泉、高光恩教授给予指导帮助，特此致谢．■
作者单位：孙秀燕（沈阳药科大学分析测试中心,沈阳　110015）
　　　　　邢山闽（解放军210医院，大连　116021）
　　　　　李明慧（哈尔滨制药总厂）
　　　　　王立群（沈阳药科大学分析测试中心,沈阳　110015）
　　　　　苑健（沈阳药科大学分析测试中心,沈阳　110015）
参考文献：
［1］李时珍．本草纲目：草部第十五卷．北京：人民卫生出版社，1982．941～943
［2］孙星衍，孙冯翼．神农本草经：卷一．台北：五州出版社，1981．32～33
［3］王占玺，张荣显，许华，等．张仲景药法研究．北京：科学技术出版社，1984．242～244
［4］蒋洁云，徐强，王蓉，等．茵陈抗肿瘤成分的研究．中国药科大学学报，1992， 23（5）：283～286
［5］潘克将，刘惠纯．茵陈蒿汤和茵陈药理研究近况及展望．中成药，1997，19（10）：46～47
［6］徐起初，杨连菊，杨春澍．茵陈的质量研究.中草药，1983，14（1）：35～40
［7］张启伟，章育中．滨蒿利胆有效成分的含量测定．药学学报，1986， 21（12）：922～927
［8］胡润生，李宝珍，陈玫．滨蒿利胆有效成分的研究．药学学报，1965，12（5）：289～294
［9］小宫威弥．茵陈蒿的研究（第一报）新利胆成分Capillarisin．药学杂志，1976,（7）：841～854
［10］王喜军，孙晖，刘中申．茵陈蒿及其复方制剂中6，7-二甲氧基香豆素和茵陈色原酮的定量研究.中国中药杂志，1994，19（11）：667～670
收稿日期：1999-06-07