RP-HPLC法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量

摘　要　用RP-HPLC以安宫黄体酮为内标物同时测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量.色谱条件：色谱柱为Spherisorb C₁₈柱；流动相为甲醇-水(62∶38，V∶V)检测波长280 nm；靛蓝和靛玉红的平均回收率分别为(99.0±1.1)%和(104.2±3.5)%.本法操作简便，结果准确.

Abstract　An analytical method for determination of indigo and indirubin in the indigowoad root and leaves by RP-HPLC was developed.The HPLC conditions were as follows:spherisorb C₁₈　column(4.6 mm×250 mm)the mobile phase,methanol-H₂O(62∶38，V∶V)detection wavelength，280 nm；internal standard,medroxyprogesterone acetate.The mean recoveries for the indigo and indirubin were(99.0±1.1)% and(104.2±3.5)%，respectively.The method was simple and accurate.
Key words　indigowoad root；indigowoad leaves；indigo；indirubin;HPLC

　　板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)和爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek.的干燥根^〔1〕.大青叶为菘蓝、马蓝和蓼科草本植物蓼蓝(Polygonum tinctorium Ait.)的枝和叶^〔2〕.板蓝根和大青叶均具有清热解毒、抗菌消炎、凉血消斑等功效，二者在中药成方中经常配伍入药，如金青感冒颗粒，小儿退热颗粒，复方板蓝根颗粒等.板蓝根和大青叶的有效成份都是靛蓝(indigo)和靛玉红(indirubin)^〔3〕.靛玉红对治疗慢性粒细胞白血病有较好疗效.靛蓝、靛玉红的含量测定方法已有氧化滴定法、直接比色测定法、薄层色谱法、双波长分光光度法、反相高效液相色谱法^〔4〕.其中反相高效液相色谱法采用外标法定量，对获得操作的重复性来说有其不足之处，本文则采用安宫黄体酮为内标物以内标法定量，结果令人满意.

1　仪器与材料

　　日本岛津公司高效液相色谱仪LC-6A系列；LC-6A溶剂输送泵；SPD-6AV紫外-可见分光检测器；LC-R3A数据处理装置；7125 20μL定量进样阀.
　　对照品安宫黄体酮、靛蓝、靛玉红(中国药品生物制品检定所)甲醇为色谱纯；氯仿为分析纯；水为重蒸馏水；板蓝根、大青叶样品购于各地药材公司.

2　方法与结果

2.1　分离条件
　　以甲醇∶水(62∶38，V∶V)为流动相，安宫黄体酮为内标物.靛蓝、安宫黄体酮、靛玉红的保留时间分别为15.8，23.8，31.1 min.靛蓝与内标物的分离度为2.90；靛玉红与内标物的分离度为1.51.
2.2　色谱条件
　　色谱柱：Spherisorb C₁₈柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)流动相：甲醇-水(62∶38，V∶V)流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：室温；进样量：20 μL.
2.3　标准曲线
　　精密称取靛蓝1.5 mg于50 mL量瓶中，靛玉红2.0 mg于100 mL量瓶中，安宫黄体酮50 mg于25 mL量瓶中，分别用氯仿溶解并稀释至刻度.精密吸取靛蓝标准液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL分别于10 mL量瓶中，各加入安宫黄体酮内标液2.0 mL，用氯仿稀释至刻度.精密吸取靛玉红标准液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别于5 mL量瓶中，各加安宫黄体酮内标液1.0 mL，用氯仿稀释至刻度.分别进样20 μL，得色谱图，计算出回归方程.靛蓝回归方程：Y=0.078 8C+0.367 2，r=0.999 9，靛蓝在2.4～12.0 μg/mL范围内呈线性.靛玉红回归方程：Y=0.156 8C-0.103 5，r=0.999 9，靛玉红在1.6～8.0 μg/mL范围内呈线性.其中：Y是靛蓝或靛玉红与安宫黄体酮峰面积之比；C是靛蓝或靛玉红的浓度.
2.4　样品测定
　　精密称取板蓝根或大青叶粗粉8 g置索氏提取器中，加氯仿100 mL，80℃回流8 h，浓缩提取液置10 mL量瓶中，加入内标液2.0 mL，用氯仿稀释至刻度，进样20 μL，得色谱图.由回归方程计算靛蓝、靛玉红的含量，并计算出药材中二成分的含量，样品色谱图及样品测定结果如图1、表1所示.

Tab.1　Content of indigo and indirubin in the idigowoad root and leaf from various origins

Fig.1　Chromatogram of idigowoad root and leaves
A—Indigo；B—Medroxyprogeterone acetate;C—Indirubin

2.5　重复性实验
　　同时提取四川大青叶(样品1)粗粉4份，按上述方法制备样品液，色谱条件同上，测定，并计算出药材中二成份的含量.靛蓝=397.4 μg/g,RSD=1.9%；靛玉红=149.7 μg/g，RSD=2.0%.
2.6　加样回收率测定
　　精密称取四川大青叶(样品1)粗粉4份，其中一份作为对照，另3份分别加入不同量的靛蓝、靛玉红对照液，按样品液方法操作，计算回收率，结果见表2.

Tab.2　Results of recovery tests

　　作者试用联苯、萘、苯甲酸苯酯、安宫黄体酮等作为内标物，从分离度和保留时间上看，以安宫黄体酮为宜；避光条件下，24 h内板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红在氯仿中稳定，时间过长，靛蓝、靛玉红分解，故应保证在24 h内完成实验；作者首次采用内标法，准确地测定了板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量，结果准确、可靠，重复性好.