四倍体板蓝根中五种有机酸成分的毛细管电泳分离分析

摘　要　选择毛细管区带电泳分离模式，以肉桂酸为内标建立了适合板蓝根药材中抗内毒素活性成分五种有机酸优化分离与定量分析的毛细管电泳方法。电泳分离条件：毛细管40 cm ×50 μm，运行缓冲液pH 9.5磷酸二氢钠-硼砂(50 mmol/L∶12.5 mmol/L，内含16 mmol/L β-CD)，压力进样20 psi×s，操作电压18kV (+)→(-)，柱上在线检测UV 200 nm，毛细管柱温25℃。
　　关键词　板蓝根； 有机酸； 抗内毒素活性成分； 毛细管电泳
　　板蓝根（Radix Isatidis）系十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，性寒味苦，具有清热解毒、凉血消肿之功效，是一味传统的中药材。为了改良菘蓝药材品种、提高活性成分含量，乔传卓等采用秋水仙碱处理萌发的菘蓝种子或幼苗生长点，获得了菘蓝同源四倍体植株，其中根与叶中的活性成分均有较大幅度的提高［1］。
　　从板蓝根中分离得到的化学成分较多，但目前有效成分尚不明确。现代医药学研究认为，中药材的清热解毒功效主要集中于其有效成分的抗内毒素作用和抗病原微生物作用［2］。刘云海已试验证实板蓝根药材具有明显的抗内毒素作用［3］，Wu XY等还从菘蓝药材中分离得到了抗内毒素活性成分五种有机酸［4］。对于中药活性成分有机酸的分离测定，常用的分析手段主要有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法 ［5］。毛细管电泳作为一种迅速发展起来的新型高效分离分析技术已在一些中药有效成分分离分析方面获得了成功的应用［6］。本文采用毛细管电泳方法分离测定了四倍体板蓝根中抗内毒素活性成分五种有机酸的含量，并与二倍体板蓝根相比较，以考察四倍体板蓝根药材的优良品质。
1　仪器与试药
　　BioFocusTM 3000毛细管电泳仪(Bio-Rad，USA)，未涂层石英毛细管40 cm×50 μm (河北永年光导纤维厂)。pH-25型酸度计（上海雷磁仪器厂），TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
　　五种有机酸对照品水杨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、丁香酸和3-（2-苯甲酸）-4（3H）-喹唑酮由第二军医大学药学院生药学教研室提供，经毛细管电泳分离鉴定均为单一电泳峰。肉桂酸购自中国药品生物制品鉴定所。四倍体板蓝根（4n）为经数代选育获得的菘蓝四倍体植株的干燥根，由第二军医大学药学院生药学教研室乔传卓教授赠送；板蓝根（2n）分别采购于上海、南京、杭州和河北安国，经鉴定均为菘蓝的干燥根。实验所用试剂均为国产分析纯，水为二次蒸馏水。
2　方法与结果
2.1　电泳操作条件
　　按要求配制实验所需各种缓冲溶液，使用前用0.45 μm的微孔滤膜过滤，并经10000 r/min高速离心脱气5 min。每天电泳操作前毛细管均依次用甲醇-水(60∶40)、0.1 mol/L NaOH、过滤重蒸水及运行缓冲液冲洗5 min。样品分析一次循环冲洗一次，连续电泳分离5次后需更换电极池中的运行缓冲液。 本实验采用压力进样：20 psi×s，正极进样，负极柱上200 nm检测。以18 kV作为操作电压，控制毛细管柱温为25℃，在pH 9.5磷酸二氢钠-硼砂(50 mmol/L∶12.5 mmol/L，内含16 mmol/L β-CD)缓冲液条件下，五种抗内毒素活性成分有机酸及其定量内标物肉桂酸在8 min之内获得了理想的分离。图1为五种有机酸对照品及板蓝根药材提取液毛细管电泳分离图谱。
Fig 1. Typical electropherograms of five organic acids in Radix Isatidis.
A: standard solution of five organic acids； B: extraction sample of Radix 
Isatidis；1. Internal standard cinnamic acid； 2. quinazolinone acid； 
3. salicylic acid； 4. benzoic acid； 5. anthranilic acid； 6. syringic acid

2.2　标准曲线的制备
　　精密配制含水杨酸105.5 μg/ml、苯甲酸92.10　μg/ml、邻氨基苯甲酸537.0　μg/ml、丁香酸109.8　μg/ml和3-（2-苯甲酸）-4（3H）-喹唑酮92.30　μg/ml的甲醇-水（30∶70）混合标准液。肉桂酸内标液由pH　9.5背景电解质（50　mmol/L磷酸二氢钠-12.5　mmol/L硼砂）配制，浓度为150.0　μg/ml。分别准确吸取混合标准液5，10，15，25，50，100　μl，加内标液100　μl，用重蒸水稀释定容至1　ml量瓶中，混匀。吸取其中80　μl，以10000　r/min高速离心5　min后，置于毛细管电泳仪中进样分析。以有机酸峰面积与内标峰面积比（Y）对相应的浓度（C）进行线性回归，计算回归方程，即水杨酸Y1=0.004315+0.01752C,r=0.9992（n=5）,定量线性范围0.5275～10.55　μg/ml；苯甲酸Y2=0.002136+0.02411C,r=0.9996（n=5）,定量线性范围0.4605～9.210　μg/ml；邻氨基苯甲酸Y3=0.005474+0.01822C,r=0.9991（n=5）, 定量线性范围2.685～53.70　μg/ml；丁香酸Y4=0.002108+0.01632C, r=0.9995（n=5）, 定量线性范围0.5490～10.98　μg/ml；3-（2-苯甲酸）-4（3H）-喹唑酮Y5=0.0009214+0.01205C,r=0.9990（n=5）,定量线性范围0.4615～9.230 μg/ml。
2.3　样品的分离分析
　　板蓝根药材烘干，粉碎，过60目筛。精密称取各药材粉末10 g，加蒸馏水500 ml，煎煮30 min；重复操作3次，合并滤液，水浴浓缩至约100 ml，加乙醇至醇浓度为80%，冷藏24 h后过滤，滤液回收乙醇至无醇味。残留液加蒸馏水定容至10 ml，并用1 mol/L HCl调pH值为1，以石油醚分次萃取、去除脂溶性杂质后，选择乙醚按2∶1萃取3次，合并乙醚液，以无水硫酸钠脱水，过滤，滤液回收乙醚。残留物以甲醇溶解并定容至2ml量瓶中。精密吸取样品液200 μl，加内标液100　μl，用重蒸水稀释定容至1　ml量瓶中，混匀。吸取其中80　μl，以10000　r/min高速离心5　min后，进行电泳分析，定量结果列于表1。
2.4　加样回收率试验
　　精密称取已知含量的四倍体板蓝根药材粉末10 g，准确加入五种有机酸混合标准液 200 μl，按板蓝根药材“样品的分离分析”项下操作，计算四倍体板蓝根药材的加样回收率，结果见表2。 
2.5　定性定量精密度
　　精密吸取五种有机酸混合标准液25 μl共5份， 添加肉桂酸内标液100　μl，按“标准曲线的制备”项下配制毛细管电泳分析标准溶液，重复进样5次，结果求得水杨酸迁移时间RSD　1.2％，相对峰面积RSD　2.1％；苯甲酸迁移时间RSD　1.5％，相对峰面积RSD　2.3％；邻氨基苯甲酸迁移时间RSD　1.0％，相对峰面积RSD　2.0％；丁香酸迁移时间RSD　1.8％，相对峰面积RSD　2.5％ ；3-（2-苯甲酸）-4（3H）-喹唑酮迁移时间RSD　0.8％，相对峰面积RSD　1.8％。
　　精密称取同一批四倍体板蓝根药材粉末10　g，按“样品的分离分析”项下步骤平行制备5份待测样品，毛细管电泳连续进样分离分析其中五种有机酸的含量，结果四倍体板蓝根药材中水杨酸浓度RSD　2.2％；苯甲酸浓度RSD　2.1％；邻氨基苯甲酸浓度RSD　1.8％；丁香酸浓度RSD　2.4％ ；3-（2-苯甲酸）-4（3H）-喹唑酮浓度RSD　2.3％。 
3　讨论
　　1)对于有机酸的毛细管电泳快速分离，一种有效的方法是采用反向电渗流毛细管电泳操作模式，但是带正电荷的电渗流改性剂易与带负电荷的酸性溶质发生不良相互作用［7］。本文选择常规毛细管区带电泳分离模式，考察了缓冲液pH、运行电压、有机添加剂等操作参数对板蓝根药材中五种有机酸电泳分离的影响，其中适量β-CD的加入，不仅改善分离选择性，而且还明显增进电迁移速率。一个合理的解释是，β-CD的包合作用在改善各样品组分相对电迁移速率的同时，本质上减少有机酸分子的负电荷密度，进而降低了本身反方向的电泳速度。在兼顾分离效率和分析速度的前提下，优选的电泳分离条件为：操作电压18kV(+)→(-)，运行缓冲液pH 9.5磷酸二氢钠-硼砂(50 mmol/L∶12.5 mmol/L，内含16 mmol/L β-CD)。
　　2)板蓝根药材的质量控制，目前尚无行之有效的评价标准。中国药典规定以靛玉红作为感冒退热冲剂的鉴定标准，事实上现有的水煮醇沉制剂工艺对脂溶性成分靛玉红的提取率极低，产品质量差异较大，因此选择靛玉红等脂溶性成分作为板蓝根及其制剂的质量控制已不可取［8，9］。至于其他文献报道板蓝根药材中氨基酸、喹唑酮等有效成分的含量测定结果，则更不足以表征药材品质的优劣［9，10］。从板蓝根药材中分离得到的五种有机酸成分，体外抗内毒素活性能真实反映其内在清热解毒之功效，较好的水溶性特征符合感冒退热冲剂的生产制备工艺，适合作为板蓝根药材及其制剂质量控制的指标性成分。本文借鉴板蓝根水煮醇沉制剂工艺进行样品分离分析的预处理，毛细管电泳有机酸活性成分的测定结果定量比较了不同产地板蓝根药材的质量，其中四倍体板蓝根的品质明显优于二倍体板蓝根。

范国荣（第二军医大学附属长海医院临床药理室，上海 200433）
　胡晋红（第二军医大学附属长海医院临床药理室，上海 200433）
　李博华（第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433）
　张汉明（第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433）
　林梅（中国药科大学药物分析学教研室，南京 210009）
　安登魁（中国药科大学药物分析学教研室，南京 210009）

参 考 文 献
1，乔传卓，吴美枢，戴富宝等.菘蓝多倍体育种的研究.植物学报，1989，31（9）：678
2，周金黄,王建华主编.中药药理与临床研究进展（第一册）.北京：中国科学技术出版社，1992.358
3，刘云海. 板蓝根抗内毒素作用研究.中国药科大学学报，1995，26（5）：297
4，Wu XY，Liu YH，Sheng WY，et　al.Chemical constituents of Isatis indigotica. Plant Medica，1996，63：55
5，陈发奎主编.常用中草药有效成分含量测定.北京：人民卫生出版社，1997.62，69，124
6，魏　伟，王义明，罗国安.中药成分的高效毛细管电泳分析.药学学报，1997，32（6）：476
7，林　梅，冯　敏，张正行等.酸性药物的反向电渗流高效毛细管电泳分离分析研究.色谱，1998，16（5）：383
8，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）.广州：广东科技出版社，1995.627
9，李　玲，乔传卓，李修禄等.大青叶和板蓝根药材及其制剂质量控制的研究.药学学报，1993，28（3）：229
10，乔章星. 板蓝根水醇提取液中氨基酸成分的测定.现代应用药学，1991，8（3）：14