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【摘要】 目的：建立预处理淋巴细胞样品后经高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）检测淋巴细胞合成和释放儿茶酚胺（catecholamines，CAs）的方法，并为淋巴细胞合成和释放CAs提供直接的证据。方法：淋巴细胞培养液上清经氧化铝吸附，高氯酸洗脱；淋巴细胞经破细胞，去蛋白，高氯酸提取；采用AtlantisC18反相色谱柱分离淋巴细胞培养液上清以及细胞中的CAs，电化学检测器检测。结果：CAs分离效果良好，22 min内完成测定，各峰形对称，杂质峰少。用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）诱导的淋巴细胞培养液上清中去甲肾上腺素含量最高，其次是多巴胺，肾上腺素最少；而Con A刺激的淋巴细胞内多巴胺的含量最高，其次为去甲肾上腺素，肾上腺素最少。结论：对淋巴细胞样品进行预处理能提高HPLC检测的灵敏度、减少干扰，这种方法可直接检测到淋巴细胞合成和释放CAs。
【关键词】 淋巴细胞；儿茶酚胺；高效液相色谱法
Objective: To establish an improved method in order to effectively determine levels of catecholamines (CAs) including norepinephrine (NE), epinephrine (E) and dopamine (DA) in the cultured lymphocytes and in the supernatants of the cultures by high performance liquid chromatography(HPLC). Methods: The CAs were extracted from lymphocytes by ultrasonication and from the extracellular medium by alumina absorption. Atlantis C18 column with electrochemical detection to was used simultaneously determine NE, E and DA in lymphocytes and the extracellular medium. Results: CAs including DA, NE and E in the concanavalin A(Con A)-activated lymphocytes and their supernatants were able to be determined. Among the three kinds of CAS, DA had the highest content(1.922×10-19 mol/L·cell), E had the lowest content (0.612×10-19 mol/L·cell), and NE had intermediate (1.452×10-19 mol/L·cell). In the supernatants, NE content was the highest (2.44×10-9 mol/L), DA medium(1.436×10-9 mol/L) and E the lowest (1.14×10-9 mol/L). Conclusion: The improved HPLC method can effectively detect CA levels including NE, E and DA in the cultured lymphocytes and the cultured supernatants, and it shows that lymphocytes have the ability to synthesize and secrete CAs.
[Key words] Lymphocyte; Catecholamines; High performance liquid chromatography
机体内儿茶酚胺（catecholamines，CAs）包括去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）。近年来研究发现，免疫细胞也能合成CAs，发挥免疫调节作用[1，2，3]。但关于淋巴细胞合成和分泌CAs的直接证据目前仍未见报道。CAs的测定方法主要有三羟基吲哚法、乙二胺缩合法、放射酶学法、气相色谱法、色质联用法及稀土离子荧光探针法等，但存在成本高、步骤繁琐，灵敏度低等缺点。随着色谱技术的发展及日趋完善，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）以其灵敏度高、重复性好的优点正逐渐取代其它检测方法，成为临床上检测生物样品中CAs含量最可靠的方法之一。然而，由于淋巴细胞合成和释放的CAs极微量，本研究对淋巴细胞样品进行前期预处理，去除干扰因素，然后再采用HPLC经AtlantisC18反相色谱柱分离，电化学检测法检测，能很好地优化检测条件，取得了满意的分离检测效果。
1 材料与方法
1.1 淋巴细胞培养 SD大鼠（SPF级），体重200～250 g，雌雄兼用，由南通大学实验动物中心提供。大鼠行颈椎脱臼法处死，无菌条件下取肠系膜淋巴结，以RPMI-1640基础培养液洗涤，碾碎，过滤，并以RPMI-1640基础培养液离心（200 g，5 min）洗涤3次。以完全培养液将细胞沉淀重悬，混匀。滴于计数板上计数，调整细胞浓度为（1~2）×106个细胞/ml，每ml细胞悬液中加入刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）5 μl，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养48小时。
1.2 样品预处理 取培养48小时后的淋巴细胞悬液，离心（200 g，5 min），将细胞与培养液分离。取分离出的培养液上清，加入等体积的0.5 mol/L的Tris（pH=10）、50 mg氧化铝（预先在105℃中烘烤至少3小时）、适量的3,4-二羟基苄胺（dihydroxybenzylamine，DHBA）作为内标，轻摇15 min，离心去上清，用超纯水洗涤沉淀3遍，再加入0.5 ml 0.5 mol/L的高氯酸，充分振荡，离心200 g×8 min后取上清，用于HPLC测定。每毫升细胞沉淀中加入150 μl的0.1N高氯酸，置于超声波细胞粉碎仪上对细胞进行破碎，后加入150 μl的0.8 N高氯酸，离心（200 g，4℃，10 min）后取上清，其中加入适量的DHBA，用于HPLC测定。
1.3 仪器和试剂 高效液相色谱仪，1525泵，2465电化学检测器，717自动进样器，Empower工作站；AtlantisC18，4.6×250 mm 柱，5 μm色谱柱；玻璃碳工作电极，即位参比电极（ISAAC电极）均为美国Waters公司生产。NE、E和DA均为美国Sigma公司产品，B8为天津试剂二厂进口分装，甲醇HPLC级，偏重亚硫酸钠等其它试剂均为国产优级纯产品。
1.4 色谱条件 （1）标准品配置：分别称取一定量的NE、E、DA，用溶解液（0.05 N HCl，偏重亚硫酸钠0.1%，EDTA·2Na 50 mg/L）溶解，配成浓度为1 mg/100 ml的储备液，分装后－80℃保存。储备液用流动相稀释1000倍，配成10 pg/μl的CAs标准品，并加适量的DHBA，限当日使用;（2）流动相配置：NaH2PO4 50 mmol/L，柠檬酸钠50 mmol/L，EDTA·2Na 20 mg/L，NaCl 2 mmol/L，B8 0.25 mmol/L，用H3PO4调pH值4.3，用0.22 μm膜过滤备用。仪器工作条件：流动相流速为1 ml/min，工作电压为0.42 V，电极工作电压为600 V，电极工作室温度为37℃。
1.5 统计学方法 本实验数据都用x±s表示，采用Stata 7.0统计软件中Student’s t检验和方差分析进行数据的处理，以P<0.05示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 色谱图 按照NE、E、DHBA、DA顺序出峰，22 min内完成测定。淋巴细胞培养液上清中NE、E、DHBA、DA的保留时间分别为5.8 min、9.4 min、11.1 min、18.8 min；淋巴细胞裂解液中NE、E、DHBA、DA的保留时间分别为5.3 min、8.5 min、9.9 min、16.6 min。各组出峰时间因受流动相流速、柱温、流动相的离子强度等的影响而略有差异。图1、2中可见各峰形对称，分离效果良好。
2.2 线性范围与最低检测限 在本色谱条件下, NE、E、DA样品量 20～2000 pg之间与峰面积有良好线性关系。最低检测限分别为: NE 0.91 pg、E 1.26 pg、DA 2.43 pg。
2.3 样品测定结果 用Con A诱导的淋巴细胞培养液上清中CAs含量及用Con A诱导的淋巴细胞裂解液中CAs含量见图3、4。
3 讨 论
CAs作为神经递质和激素与人们的健康和疾病有密切关系[1]。传统观点认为，CAs主要由神经细胞和内分泌细胞合成和释放，近年来研究发现，免疫细胞也能合成和释放CAs，并通过自分泌和旁分泌途径作用于自身，发挥免疫调节作用[2~5]。我们以往的研究证明淋巴细胞内存在合成CAs的酶TH[2，3]。本研究中我们发现，Con A刺激的淋巴细胞培养液上清中NE含量最高，其次是DA，E含量最少；而Con A刺激的淋巴细胞内DA的含量最高，其次为NE，E最少。
目前临床上建立的高效液相色谱电化学检测法主要是检测血中和尿中CAs的含量，而高效液相色谱法又包括电化学检测、紫外检测和荧光检测法等，其中高效液相色谱电化学检测法灵敏度最高，方法简单、快速、重复性好[6]。以往我们检测之前对样品不做特殊处理并使用外标法进行分析[2，3，7]，由于淋巴细胞培养液上清及细胞裂解液中包含许多复杂成分，所以结果虽能检测到DA、NE、E，但DA、NE、E 3种物质检测峰之间可见许多杂质峰，只能靠与同等色谱条件下检测出的标准品中3种检测峰位置的对比来确定DA、NE、E的位置。因此我们选用内标法分析，并对样品进行浓缩和纯化[5, 6, 8]。淋巴细胞培养液上清先经氧化铝吸附CAs、以去除培养液中的复杂成分，然后用高氯酸洗脱CAs，以便上样检测；细胞中加入低渗的高氯酸进行裂解，再用高浓度的高氯酸去除蛋白，得到纯化的样品。经过这样的处理，淋巴细胞培养液上清以及细胞裂解液中的CAs得到了浓缩和纯化，去除了杂质峰。同时，我们在标准品和样品中添加DHBA作为内标，根据DHBA检测峰的位置，再结合标准品，使DA、NE、E检测峰的位置一目了然，以便于结果的统计分析。
本研究一方面为淋巴细胞合成和释放CAs提供了直接的证据，另一方面通过对样品进行预处理，使测定CAs的高效液相色谱电化学检测法更稳定、干扰更少，方法更准确、可靠。样品预处理方法比较简单、快速，能满足细胞样品中低含量或微量CAs的检测，适用于临床诊断和科研工作中生物样品微量CAs的测定。
【参考文献】
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[6] Cosentino M, Bombelli R, Ferrari M, et al. HPLC-ED measurement of endogenous catecholamines in human immune cells and hematopoietic cell lines [J]. Life Sciences, 2000, 68（3）: 283-285.
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[8] Marino F, Cosentino M, Bombelli R, et al. Endogenous catecholamine synthesis, metabolism, storage, and uptake in human peripheral blood mononuclear cells[J]. Experimental Hematology, 1999, 27(6): 489-490.