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【摘要】 目的 建立全血中西罗莫司的UPLC(超高效液相色谱)/MS/MS测定方法。方法 全血样品中加入他克莫司(FK506)作内标，用叔丁基甲醚进行提取。以乙腈与含千分之五甲酸的水溶液为流动相(40∶50)，色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C8(50mm×2.1mm，1.7μm)，流速0.5ml/min。三重四极杆质谱采用正离子模式，离子采集方式为多反应监测模式(MRM)，离子源温度105℃，离子源电离电压为3300V，雾化气流速500L/h。采集离子(母离子/子离子)西罗莫司为931.2/864.1，FK506为822.0/577.0。结果 西罗莫司在1～240μg/L浓度范围内呈良好的线性(r=0.9995)。日内、日间精密度均在15%以内，提取回收率大于75.0%，方法回收率为95.0%～98.5%，最低检测限为0.2μg/L。结论 本方法灵敏、准确，适合临床西罗莫司的全血分析。
【关键词】 超高效液相色谱质谱联用 血药浓度 西罗莫司
Determination of sirolimus in whole blood by UPLC/MS/MS
ABSTRACT Objective To establish a UPLC/MS/MS method for the detemination of sirolimus in whole blood. Methods The blood sample was extracted with methyl tertbutyl ether and separated over an ACQUITY UPLCTM BEH C8 (50mm×2.1mm, 1.7μm). The mobile phase consisted of a mixture of water (0.5% formic acid) and acetonitrile (50∶40). The flow rate was 0.5ml/min. Tacrolimus (FK506) was used as an internal standard. The triple quadrupole mass spectrometer with the turbo ion spray interface was operated in the positive ion mode and the temperature of the turbo was set at 105℃ and the ionization voltage was 3300V. The multireaction monitoring (MRM) mode was employed to scan the ions. The selected ions (precursorion/product ion) were 931.2/864.1 for sirolimus and 822.0/577.0 for FK506. Results The calibration linear range of bloodsirolimus concentrations was 1 to 240 μg/L (r=0.9995). The betweenday and withinday RSD% were less than 15%. The extraction recoveries were more than 75.0% and the method recoveries were between 95.0% and 98.5%. The low limit of detection was 0.2μg/L. Conclusion The UPLC/MS/MS method is rapid, sensitive and reliable and can be applied to monitor sirolimus of whole blood.
KEY WORDS UPLC/MS/MS; Whole blood; Sirolimus
西罗莫司(sirolimus)是一种新型、强效大环内酯类免疫抑制剂，由于治疗用剂量低(0.01～0.3mg/kg)，个体差异大，治疗指数窄，特别对特殊患者(儿童，肝功能不良者)血药浓度监测是非常必要的。另外，由于西罗莫司免疫抑制作用与稳定态的谷浓度(Cmin)相关，需要灵敏的检测方法。超高效液相色谱(UPLC)技术作为近年来发展起来的分离技术，与传统的液相色谱相比具有更高的分离效率和更快的分离速度，尤其与质谱联用更能显示其优越的性能，本文采用UPLC/MS/MS方法分析检测血中西罗莫司的浓度。该方法的灵敏度高(最低检测限为0.2μg/L)，分离速度快，优于文献报道的LC/MS/MS测定法［1～3］。
1 材料与方法
1.1 仪器
美国Waters液质联用仪，AcquityTM超高效液相色谱(Ultra performance LC)系统； Quattro PremierMICROMASS质谱仪，MsssLynx工作站；十万分之一电子分析天平(Sartorius)。
西罗莫司对照品(华北制药新药中心试制)；他克西司(FK506，华北制药新药中心提供)；叔丁基甲醚、甲醇及乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。
1.2 溶液的配制
西罗莫司溶液 精密称取西罗莫司对照品10.0mg，置100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为西罗莫司的储备液(100mg/L)，置-20℃冰箱保存，使用当天将储备液用乙腈稀释至所需浓度。
内标溶液 精密称取FK506对照品10.0mg，置500ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为内标储备液(20mg/L)，置4℃冰箱保存。使用当天将内标储备液用乙腈稀释至所需浓度(1.0mg/L)。
缓冲液 将4.11g乙酸钠固体溶于100ml去离子水中，用乙酸调pH值至4.6，定容至500ml。
1.2 方法
(1) 样品处理方法 取抗凝全血样品1.0ml，置15ml塑料试管中，准确加入20μl内标溶液(20ng)，再加入乙酸盐缓冲液(pH4.6)1ml，叔丁基甲醚5ml，混旋30min后，离心(3000r/min)10min，取上清，氮气吹干。加1∶1的乙腈水溶液100μl溶解进样。
(2)色谱及质谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C8(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：水(含0.5%甲酸)∶乙腈(40∶60)；流速0.5ml/min；进样量10μl；三重四极杆质谱采用正离子模式，离子源温度设为105℃，离子源电离电压为3300V，雾化气流速为500L/h。离子采集方式采用多反应监测模式(MRM)，采集离子(母离子/子离子)西罗莫司为931.2/864.1，FK506为822.0/577.0。
2 实验结果
2.1 方法专属性考察
取空白全血1.0ml，按“全血样品处理”步骤操作，进样10μl，得提取离子色谱图(Fig.1)，将一定浓度的西罗莫司对照品溶液和内标溶液加入空白全血，同法操作，得提取离子色谱图；取一个用药的全血，加入内标，同法操作，得提取离子色谱图。结果表明，全血中内源性物质对西罗莫司和内标的测定都不干扰。
2.2 标准曲线及检测限
取不同体积西罗莫司对照品溶液加入到1.0ml全血中，配制成一系列浓度的全血样品，浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0和240.0μg/L，加入内标后按“全血样品处理”项提取后进样测定；以浓度(C，μg/L)为纵坐标，西罗莫司与内标峰面积比值(A)为横坐标，进行线性回归，血药浓度在1～240μg/L范围内有良好的线性关系，最低检测限为0.2μg/L。回归方程为：
C=24.888A-0.4376 r=0.9995
2.3 精密度考察实验
取空白全血1.0ml，配制低、中、高三个浓度(2、16、128μg/L)的溶液，加入内标后按“全血样品处理”项提取后进样测定(n=5)。连续测定5d，分别求得日内、日间精密度，RSD%均在15%以内，满足生物样品分析要求，结果见Tab.1。
2.4 提取回收率和方法回收率考察
取空白全血1.0ml，配制低、中、高三个浓度(2、16、128μg/L)的溶液，加入内标后按“全血样品处理”项提取后进样测定，记录西罗莫司的峰面积A；分别用1∶1的乙腈水配置上述3个浓度的对照品溶液，同样条件下进行测定，记录西罗莫司峰面积Asd，全血中西罗莫司提取回收率=A/Asd×100%。分别配置3个浓度的全血样品进行提取测定，方法回收率用测定浓度与配置浓度的比值(%)表示，结果见Tab.1。全血中西罗莫司的提取回收率在75%以上，方法回收率在95.0%～98.5%之间。
2.5 稳定性考察
取-20℃保存的低、中、高(2、16、128μg/L)三种浓度全血样品，放置室温，反复冻融三次，加入内标后按“全血样品处理”项提取后进样测定，测定结果与理论值比较，误差在±15%以内。样品提取后的稳定性也进行了考察，低、中、高三种浓度(2、16、128μg/L)全血样品处理完后，与室温放置0、3、6和9h后测定，测定结果与理论值比较，误差在±15%以内。符合生物样品分析要求。
3 讨论与结论
他克莫司(FK506)的色谱行为与西罗莫司很相近，故选作内标。其二级质谱离子(822.0/577.0)灵敏度高且稳定；在血液中西罗莫司大部分与红细胞结合，其余部分与血浆脂蛋白结合［4］，所以测定血药浓度需用全血。由于测定全血时干扰物质较多，国外文献曾采用反相C18固相萃取柱处理样品［1］，操作费时且重现性差。本实验采用液液萃取处理样品，超高效液相色谱分离，去除了全血中内源性物质的干扰，方法简便省时，克服了采用固相萃取的缺点。另外，由于该药剂量小，血药浓度低、治疗范围窄及检测稳定态谷浓度的要求，检测方法必须灵敏准确，现有分离方法均为HPLC分离；采用超高效液相色谱技术，大大提高了分离效能，改善了分离度，缩短了保留时间，使色谱峰变得更窄、更高，质谱为浓度型检测器，当色谱峰变窄时，信噪比会更高，灵敏度可以提高数倍。
我们所建立的UPLC/MS/MS新方法，利用了超高效液相色谱的柱效高、灵敏度高，省时以及MS/MS检测器的特异选择性等优点，使该方法具有样品处理简单，方法灵敏、快速、选择性强，满足了西罗莫司体内药物监测的要求。本方法不足之处是新型仪器UPLC/MS/MS价格偏高。
【参考文献】
［1］ David W H, Terry L, Kirsty J, et al. Validation of an assay for routine monitoring of sirolimus using HPLC with mass spectrometric detection ［J］. Clin Chem,2000,46(8):1179
［2］ Cattaneo D, Perico N, Gaspari F. Assessment of sirolimus concentrations in whole blood by high performance liquid chromatrography with ultraviolet detection ［J］. J Chromatogr B,2002,774(2):187
［3］ Shi Y H, Li Z D, Shi X J, et al. Determination of sirolimus concentration in human whole blood by HPLC ［J］. Chin J Clin Pharm(中国临床药学杂志),2004,13(2):76
［4］ Ren B, Li S X, Deng B, et al. Determination of sirolimus in human whole blood by HPLC ［J］. Chin Pharm J