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摘 要 采用高效液相色谱法定量分析仿生杀菌剂邻烯丙基苯酚在草莓果实中的消解动态和最终残留。结果表明，施药处理的草莓果实的果浆用丙酮提取，经石油醚萃取、浓缩和定容后采用高效液相色谱分析（HPLC）方法，在273 nm波长检测条件下，标准曲线方程为Y = 10.049X－44.395, (R2=0.997)。经测定，邻烯丙基苯酚的最低检出量为4.2 ng，在草莓中的最低检出浓度是0.02 mg/kg。本方法的添加回收率为797%～84.6%，相对标准偏差1.78%～4.01%。测定邻烯丙基苯酚在草莓中的消解动态及最终残留显示，药剂在草莓中的半衰期为4.40 d，草莓收获时药剂的消解率在90%以上。
关键词 高效液相色谱，仿生杀菌剂，邻烯丙基苯酚，残留分析，消解动态，草莓
1 引 言
邻烯丙基苯酚（oallylphenol，商品名称银果）是山东省莱阳农学院经过16年研制成功的以植物源活性成分为模版合成的农用仿生杀菌剂，获得国家发明专利（ZL 97 121 037. 3）[1]。该杀菌剂对4个亚门8个属的多种植物病原真菌具有抑菌活性[2]；田间药效实验表明，其对草莓灰霉、草莓白粉、番茄灰霉和苹果腐烂等病害均具有很好的防治效果［３］。本研究室进行的药理学研究证实：邻烯丙基苯酚是一种具有内吸和自基向顶传导作用的杀菌剂，其内吸传导是一种受体植物主动吸收的过程[4]。草霉属桨果类植物，果实为直接食用的部分。近年来我国草莓的设施栽培面积迅速扩增，叶部和果实病害逐年加重。草霉对农用杀菌剂的吸附特征区别于其它类别的果实和蔬菜，政府和公众对草莓果实上农药的残留问题日益关注。因此，探明该药剂在草莓果实中的消解及残留，评价药剂的安全性具有十分重要的意义。
2 实验部分
2.1 材料和仪器邻烯丙基苯酚标准品（含量≥99%，山东省莱阳农学院农药仿生应用工程技术研究中心）；10%银果乳油（山东京蓬生物药业股份有限公司）；丙酮、石油醚为分析纯，甲醇为色谱纯（北京化工厂产品）。LC10AT高效液相色谱仪（含四元泵、脱气机及二极管阵列检测器, 色谱柱：HYPERSIL BDS C18 5 μm 250×4.6 mm (i.d) 色谱柱，日本岛津公司）及classvp色谱工作站；搅拌机GL118（北京硕人商贸有限公司）；BüCH旋转蒸发仪RE111（日本）；SHBⅢ循环水式多用真空泵、低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；RC5C高速冷却离心机（日本）；电子天平（精度0.0001g，上海海康电子仪器厂）；利农16 Ｌ背负式喷雾器（新加坡利农AGROLEX公司）。
2.2 实验方法
2.2.1 实验材料及培育管理 草莓品种为丰香（莱阳农学院提供），种植于中国农业大学科学园。依据农药田间药效实验准则施药处理[６]。药剂在草莓上的消解动态实验设置10%银果乳油133 g/AI (商品量,下同) 喷雾处理及清水对照；最终残留实验设置10%银果乳油133 g/AI和83 g/AI喷雾和不施药（喷雾清水）空白对照三个处理。两个实验中各处理的草莓小区面积均为15 m2，3次重复。施药时间选定在草莓开花初现果实时, 用AGROLEX SPRAYER JACTO HD400利农16 Ｌ背负式喷雾器均匀喷施草莓植株，消解动态实验仅一次施药（2005年2月2日），最终残留实验每隔7 d施药一次，共用药4次。
2.2.2 样品的提取和前处理 称取30 g草莓果实，用榨汁机制成匀浆，转入100 mL离心管中，加丙酮50 mL，振荡器上处理20 min，离心。取上层有机相，下层残渣用50 mL丙酮再振荡处理20 min，离心。合并有机相于250 mL分液漏斗中，分别加入100、50 mL石油醚二次萃取，合并上层有机相于平底烧瓶中，浓缩蒸干，用1 mL甲醇定容，待测。
2.2.3 HPLC条件 色谱柱：250 mm×4.6 mm 不锈钢柱，SHIMPACK VPODS球型硅胶填料，配备C18预柱；检测波长：273 nm；流动相：甲醇∶水= 65∶35 (V/V)梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。
2.2.4 邻烯丙基苯酚标准溶液的配制 准确称取邻烯丙基苯酚标准品0.1220 g，用甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀得4880 mg/L邻烯丙基苯酚标准溶液。将此邻烯丙基苯酚标准溶液稀释至0.82、1.63、3.05、6.10、12.20、24.40和48.80 mg/L ７个浓度梯度，按上述HPLC条件测定，得相应的峰面积。
2.2.5 添加回收率实验 在50 g的空白对照草莓果实样品中添加不同水平的药剂标准溶液，按2.2.2处理方法进行提取、净化，三次重复，在HPLC条件下进行定量分析，测定添加回收率。
2.2.6 邻烯丙基苯酚在草莓果实中的消解与残留测定 消解动态实验取样时间分别为施药后0、1、2、3、5、7、9、15 d；最终残留实验取样时间在最后一次施药后7 d进行。均采用对角线5点取样法进行取样，每小区采集样本约250 g，密封于聚乙烯袋中, 放置在-20℃冰箱中贮存，备检测用。
3 结果与讨论
3.1 HPLC方法学考察结果
3.1.1 最大吸收波长的选择 在190～400 nm范围内对邻烯丙基苯酚的甲醇溶液进行全波长扫描检测（图1），确认在273 nm下邻烯丙基苯酚具有最大吸收，将此波长作为相关分析的检测波长。
3.1.2 标准曲线和线性关系 吸取2.2.4中邻烯丙基苯酚7个系列浓度梯度标准溶液各10 μＬ，由低向高浓度分别进样，进样绝对量分别为8.2、16.3、30.5、61.0、122.0、244.0和488. 0 ng，每一浓度重复进样2次。以注入的标准溶液质量浓度X (mg/L)为横坐标，所测得的峰面积Y（mV?min）为纵坐标，回归作图，邻烯丙基苯酚标准溶液的线性回归方程为：Y=1.0049X－44.395，相关系数(R2) 为0997，显示在0.82～4880 mg/L浓度范围内线性关系良好。
3.1.3 分析方法的准确度、精密度和灵敏度 由邻烯丙基苯酚在草莓中的回收率测定结果显示，草莓空白添加浓度在0.05～1.00 mg/kg范围内，平均回收率为79.7%～84.6%（表1）。HPLC测定的草莓果实空白对照样品图谱（图１）和添加样品图谱（图2）。
图1 草莓果实空白对照样品的色谱图 略
表1 添加回收率测定结果 略
图2 邻烯丙基苯酚草莓添加样品色谱图 略
添加浓度（spiked concentraiton） 0.40 mg/kg。由于邻烯丙基苯酚在丙酮中的溶解度较大，草莓样品前处理中通过多种提取有机溶剂组合比较（表2），其中二种有机溶剂的组合，为第一种溶剂溶解后，用等量的第二种溶剂萃取二次。用石油醚萃取得到的杂质较少，干扰峰响应值低，最终选用丙酮与石油醚的组合。采取特定的梯度洗脱条件，可以提高目标峰与杂质吸收峰分离度，添加回收率也相应提高。
3.1.4 梯度洗度的条件优化 图３右侧纵坐标表示分析条件的流动相中水的体积百分比。比较左右图，在固定的流动相比例条件下，目标峰与杂质的干扰峰重叠，难以分辨；但从右图中可见，改变流动相比例后（表３），水的比例加大，流动相极性增大，使得目标峰出现时间延后，与杂质峰分离，响应值也相应提高。
表2 邻烯丙基苯酚提取溶剂的选择 略
图3 HPLC分析中不同流动相中水的比例的分离效果比较 略
3.2 邻烯丙基苯酚在草莓中消解动态和残留
3.2.1 消解动态 在田间条件下,邻烯丙基苯酚在草莓中的消解动态检测结果见图4。对消解动态数据进行回归处理得：C= 43545e-0.2036t，R2= 0.9316。由此计算得出，邻烯丙基苯酚在草莓中的半衰期为4.40 d。草莓施药第15 d后，邻烯丙基苯酚在草莓中的残留量为0.13 mg/kg，消解率达90%以上。邻烯丙基苯酚的消解半衰期为4.40 d，降解速率较快，除与邻烯丙基苯酚自身结构有关外，还与果实的生长系数、实验环境条件等影响农药残留消解的因素有关，尤其以温度和光照更为显著。
3.2.2 最终残留 当10%银果乳油以１３３ g/AI和８３ g/AI用量分４次施药于草莓处理区，第４次施药7 d后草莓果实收获时的最终残留量分别为051、0.36 mg/kg（见表4）。相关的毒理学实验表明，10%邻烯丙基苯酚乳油属低毒及轻度蓄积农药，其在推荐使用剂量施药次数及距最后一次施药15 d后在草莓果实中的残留量是0.36 mg/kg，邻烯丙基苯酚在草莓上的残留量较低。
图4 草莓中邻烯丙基苯酚的消解动态 略
表4 邻烯丙基苯酚在草莓果实样品中的最终残留 略
参考文献
1 Meng Zhaoli(孟昭礼), Shang Jian(尚 坚), Shi quanwen(史全文) . Chinese Patent(中国专利), CN1214334A, 1999
2 Meng Zhaoli(孟昭礼), Luo Lan (罗 兰), Shang Jian(尚 坚). Journal of Laiyang Agricultural College(莱阳农学院学报)， 1998， (3): 159～162
3 Meng Zhaoli(孟昭礼), Yuan Zhonglin(袁忠林), Qu Baohan(曲宝函). Chinese Journal of Fungicide(农药), 1999， (5): 24～26
４ Zhang Long(张 龙), Liu Xili(刘西莉), Li Jianqiang(李健强)，Meng Zhaoli(孟昭礼)，Qu Baohan(曲宝涵)，Zhang Wenhua(张文华). Chem. J. Chinese Universities(高等学校化学学报)， 2004, 4: 654~658
５ Industry Criterions of Agriculture of PRC(中华人民共和国农业行业标准). Quality Criterions of Agriculture(农业质量标准)， NY/T 7882004, 2004： 29～33
６ Institute of the Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture(农业部农药检定所).
1(中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100094)
2(莱阳农学院植保系，山东 266109) 3(深圳市农作物良种引进中心，深圳 518040）