金胆胶囊中龙胆苦苷的定性定量研究

　　【摘要】  目的 建立金胆胶囊的定性定量分析方法。方法 采用薄层色谱法对金胆胶囊中的龙胆进行鉴别；HPLC法对金胆胶囊中的龙胆苦苷进行含量测定，色谱柱: DiamonsilTM 柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm) ；流动相: 甲醇水（体积比30∶70），流速1.0 mL/min；柱温:30 ℃；检测波长：270 nm。结果 金胆胶囊与龙胆苦苷对照品在相同的位置上显绿色荧光斑点；龙胆苦苷标准曲线的回归方程为: A=257.26 ρ+ 0.1058，r=0.999 9，在0.02～0.32 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好，平均回收率为99.37％，RSD＝2.20％（n＝5）。结论 所建立的定性定量方法简便易行，专属性强，重现性好，可作为控制金胆胶囊质量的方法。

　　【关键词】  金胆胶囊；龙胆苦苷；薄层色谱法；高效液相色谱法

　　Qualitative and quantitative analysis of gentiopicroside in Jindan capsules

　　PAN LiMing,WANG Qing

　　1. School of Chinese Materia Medica，Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou,Guangdong 510006, China；

　　2. School of Pharmaceutical Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin,Heilongjiang 150076, China

　　Abstract:Objective To establish a method for analyzing Jindan capsules.Method Gentiopicroside in Jindan capsules was analyzed by TLC. The content of gentiopicroside was determined by HPLC using a DiamonsilTM column (200 mm ×4.6 mm, 5  μm). The mobile phase consisted of methanolwater（30∶70）with a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 270 nm.Result  Jindan capsule and the control gentiopicroside had the same green fluorescence spot on TLC. The standard curve of gentiopicroside was as following: Y=257.26x+0.1058(r=0.999 9) with a good linearity over the range of 0.02～0.32 mg/mL. The average recovery of gentiopicroside was 99.37% with RSD  2.20% (n=5). Conclusion The method is sample and reproducible for the quality control of Jindan capsules.

　　Key words:Jindan capsules;  gentiopicroside；TLC;  HPLC

　　金胆胶囊是由龙胆、金钱草、茵陈、虎杖等13味药材组成的复方制剂，具有清热祛湿、理气化瘀、疏肝利胆等功能，临床上用于治疗急慢性胆囊炎、胆结石。龙胆为方中君药，具有利胆、抗炎、健胃、降压等作用。龙胆中主含环烯醚萜苷类成分, 龙胆苦苷为其中主要有效成分［1,2］。为控制其质量，本文对处方中的龙胆进行了定性定量研究，现报道如下：

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器

　　Agilent1100高效液相色谱仪包括：真空脱气机，四元梯度泵，自动进样器，二极管阵列检测器（DAD检测器）；AS3120A Ultrasonic Cleaner超声波清洗器（Automatic Science［TianJin］）；分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；R202 旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司）。

　　1.2  试剂与药品

　　甲醇为色谱纯；硅胶GF254板（青岛海洋化工厂）；正丁醇、无水乙醇、乙酸乙酯等试剂均为分析纯；龙胆苦苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0770200004）；金胆胶囊样品（自制，批号为20071027、20071030、20071102）。龙胆药材购买自广州致信中药饮片有限公司，经广东药学院中药鉴定教研室刘基柱老师鉴定为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag。

　　2  龙胆的薄层鉴别

　　2.1  龙胆对照药材溶液的制备

　　称取龙胆药材适量，研细，取10 g，加入甲醇50  mL，超声处理30 min，滤过，滤液用等量的乙酸乙酯萃取3次，分取乙酸乙酯萃取部分的溶液，浓缩至1  mL，作为对照药材溶液。

　　2.2  龙胆苦苷对照品溶液的制备

　　精密称取龙胆苦苷对照品加甲醇制成1  mL含0.9  mg的对照品溶液。

　　2.3  金胆胶囊供试品溶液的制备

　　取本品10粒，倾出其中粉末称重4.54 g，加入甲醇50  mL，超声提取40 min，过滤，滤液用等量的乙酸乙酯萃取2次，分取乙酸乙酯溶液，减压浓缩至1   mL，作为金胆胶囊供试品溶液。

　　2.4  阴性对照溶液的制备

　　除龙胆外，按处方配制诸药，照供试品制备工艺操作，取约5 g研匀，按“2.4”项下法制得阴性对照溶液。

　　2.5  薄层层析

　　吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液及对照药材溶液各10 μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以氯仿甲醇水（体积比30∶10∶3）为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm) 下检视［2］。供试品色谱中，在与对照品色谱中相应的位置上（Rf=0.57），显相同绿色荧光斑点，而阴性对照色谱在相应的位置上则无斑点。见图1。

　　3  龙胆苦苷的含量测定

　　3.1  色谱条件［2-4］

　　色谱柱为DiamonsilTM十八烷基键合硅胶柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱温为30℃；流动相为甲醇水（体积比30∶70），流速1.0  mL/min；检测波长为270 nm；进样量为10 μL。

　　3.2  溶液的制备

　　3.2.1  供试品溶液的制备

　　精密称取金胆胶囊细粉1.5 g，置索氏提取器中，加入三氯甲烷适量，回流提取至无色，弃去三氯甲烷液，挥干，加入体积分数50%的甲醇50  mL超声提取30 min，滤过。将滤液注入50 mL容量瓶中，加体积分数50%的甲醇定容至刻度。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液即得。

　　3.2.2  龙胆药材溶液的制备

　　精密称取龙胆药材（过500 μm筛）1.0 g，按“3.2.1”项下方法制备得对照药材溶液。

　　3.2.3  阴性样品溶液的制备

　　除去龙胆，其他药材按照组方配制，照供试品制备工艺操作，取约1 g研匀，按“3.2.1”项下方法制备得阴性样品溶液。

　　3.2.4  对照品溶液的制备

　　精密称取龙胆对照品10 mg以甲醇溶解定容至25  mL，分别取出0.5、1、2、4、8  mL加甲醇稀释至10  mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即为标准曲线测定用对照品溶液。

　　3.3  系统适用性试验

　　分别吸取对照品溶液和供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。理论塔板数以龙胆苦苷计不得小于5 500, 峰不对称度在0.95～1.05之间，龙胆苦苷色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5，方中其余各药味对龙胆苦苷色谱峰测定无干扰。结果见图2。

　　3.4  线形关系考察

　　取“3.2.4”项下系列质量浓度的对照品溶液各10 μL，分别进样测定，以对照品溶液质量浓度为横坐标（ρ），峰面积为纵坐标（Α），绘制标准曲线，得回归方程：Α=257.26ρ+0.1058，r=0.9999，表明龙胆苦苷在0.02～0.32 mg/mL范围内，峰面积与质量浓度呈良好线性关系。

　　3.5 精密度试验

　　精密吸取质量浓度为0.08 mg/ mL龙胆苦苷对照液10 μL，重复进样6次。测得龙胆苦苷峰面积积分值RSD为0.60％。表明仪器精密度良好。

　　3.6  重复性试验

　　取同一批号（20071030）的金胆胶囊样品，称取5份，每份约1.50 g，按“3.2.1”项下方法制备溶液，测定峰面积积分值，计算RSD值为1.56％，表明重现性良好。

　　3.7  稳定性试验

　　取样品约1.50 g，按“3.2.1”项下方法制备溶液，分别置透明量瓶中，于0、1、2、4、6、8 h进样分析，测定样品中龙胆苦苷峰面积，室温条件下RSD值为1.35%，说明龙胆苦苷在8 h内稳定性好。

　　3.8  加样回收率试验

　　精密称取已知含量的金胆胶囊粉末约1.50 g，共5份，精密加入龙胆苦苷对照品溶液（0.3312 mg/ mL） 10.0 mL，按“3.2.1”项下方法制备溶液，依法测定，平均回收率为99.37％，RSD＝2.20％（n＝5）。表明本方法的回收率较好，见表1。表1  龙胆苦苷加样回收率试验结果（略）

　　3.9  样品含量测定

　　取不同批号金胆胶囊3批，按“3.2.1”项下方法制备溶液，进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中龙胆苦苷的含量，结果龙胆苦苷的平均含量为0.224%，RSD为1.57%(n=3)。

　　4  讨 论

　　4.1  金胆胶囊的薄层鉴别中,采用阴性样品进行对照试验,经多个批次样品的试验,证明方法重现性好,阴性无干扰，斑点清晰。

　　4.2  高效液相色谱法测定含量时，进样时要控制进样速度，尽可能均匀进样，以防止由于进样不均匀，而导致分离度不好、色谱峰不理想等现象。

　　4.3  本试验建立了金胆胶囊中龙胆苦苷的含量测定方法，HPLC法测定龙胆苦苷的含量,方法简便可靠,结果准确,可用于该制剂的质量控制。但如果要更全面的控制本制剂的质量，则应对制剂中其他药材也进行薄层色谱鉴别和有效成分含量测定研究，及建立制剂指纹图谱的控制方法。

　　【参考文献】

　　［1］徐国钧，徐珞珊.中国药材学［M］.北京：中国医药科技出版社,1996: 365.

　　［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学工业出版社，2005:64.

　　［3］侴桂新，董婷霞，詹华强，等.龙胆药材中龙胆苦苷含量测定样品制备方法比较［J］. 现代中药研究与实践，2004，18（5）：38-40.

　　［4］黄志海，林生文.SPE-高效液相色谱法测定鼻咽清毒颗粒中龙胆苦苷的含量［J］.中药材，2005（6）：123.