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【摘要】 目的建立测定白花蛇舌草中3，4-二羟基苯甲酸甲酯含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法采用ODS柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇-0.05%磷酸水溶液(15∶85，V/V)为流动相,在254 nm波长处检测。3，4-二羟基苯甲酸甲酯浓度在2.5～50 μg·ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 4）；样品的加样回收率为100.4%（n=9）；结果精密度及重复性良好，RSD均不大于2.6%。结论该法简便、准确，可以作为对白花蛇舌草药材进行质量控制的一种定量。
【关键词】 高效液相色谱法 白花蛇舌草 3，4-二羟基苯甲酸甲酯
白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd．的干燥全草，主产于我国长江以南各省。本品具有清热解毒、活血化淤、利湿通淋等作用，主要用于肿瘤、黄疸型肝炎、肠炎、肺炎等疾病的治疗。白花蛇舌草中含有蒽醌类、黄酮类、环烯醚苷萜类、甾醇类、酚酸类化合物等［1～3］。有关白花蛇舌草中化学成分的分析与测定大部分是针对其中有效成分齐墩果酸及熊果酸。现代药理研究表明，酚酸类化合物具有明显的抗氧化、清除自由基作用，具有抗炎、抗菌、抗癌等作用［4］，这与白花蛇舌草的作用一致。本文首次从白花蛇舌草中分离得到了酚酸类化合物3，4-二羟基苯甲酸甲酯，并首次建立了高效液相色谱法对来自8个产地的药材中的该化合物进行含量测定。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪，包括LC-10AT型泵、SPD-10A型紫外可见检测器（日本岛津）；ANASTAR色谱工作站（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；十万分之一天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为重蒸水(自制)；3，4-二羟基苯甲酸甲酯对照品为本研究室提取分离，经UV、1H-NMR 及13C-NMR 鉴定结构,HPLC面积归一化法测定含量大于98.5％；不同产地的白花蛇舌草药材，从各地药材市场购买，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备精密称取本品对照品2.50 mg，置25 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液1.0 ml，置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得浓度为10 μg·ml-1 的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备取药材粉末3 g（过40目筛），精密称定，用15倍量90%乙醇加热回流提取3次，0.5 h/次，过滤，合并滤液。减压蒸干溶剂。残渣用流动相溶解并转移至25 ml量瓶中，定容，摇匀,过0.45 μm滤膜，即得。
2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为DiamonsilTM ODS柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇-0.05%磷酸水溶液(15∶85)，流速0.8 ml·min-1；检测波长254 nm；柱温为室温；进样量20 μl。对照品和供试品溶液的色谱图见图1～2。由图2可见，3，4-二羟基苯甲酸甲酯峰与相邻峰达到了完全分离。以3，4-二羟基苯甲酸甲酯计算理论板数不低于8 000。
图1 对照品色谱图（略）
图2 供试品色谱图（略）
2.4 线性关系的考察 精密吸取对照品储备液 0.25，0.5，1，2，3，5 ml，分别置于 10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。取 20 μl注入液相色谱仪中，记录峰面积；以浓度（C，μg·ml-1)为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A=5.01×104C-3.10×104(n=6)，相关系数r=0.999 4，表明本品在 2.5～50 μg·ml-1范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，RSD为 2.3%，表明方法精密度良好。
2.6 重复性实验 取同一产地白花蛇舌草药材，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，测定含量，其平均值为87.0 μg·g-1，RSD为2.6％，结果表明方法重复性良好。
2.7 稳定性实验 将供试品溶液室温放置，分别于 0，1，2，4，8，12 h进样分析，记录峰面积，RSD为2.8％，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。
2.8 回收率实验 取同一产地已知含量的白花蛇舌草药材粉末1.5 g（过40目筛）9份，精密称定，分别精密加入一定体积（分别为0.5，0.5，0.5，1.0，1.0，1.0，1.5，1.5，1.5 ml）的对照品贮备液（100 μg·ml-1），按“2.2”项下方法操作制备供试液，在上述色谱条件下进行测定，本法平均回收率为 100.4%，RSD为1.7 %。
2.9 样品含量测定 取不同产地白花蛇舌草药材，按“2.2”项下方法操作制备供试品溶液，测定含量。结果见表1。
3 讨论
3.1 提取条件的选择 本实验比较了用乙醇、甲醇、水作溶剂，用超声或回流提取法提取3，4-二羟基苯甲酸甲酯的提取效率。结果表明，用乙醇回流提取的效果最佳，故本文选择乙醇作提取溶剂，采用回流提取的方法。在此基础上，采用正交试验设计优化3，4-二羟基苯甲酸甲酯的提取方法。选择提取液乙醇浓度、溶剂用量、提取次数、提取时间4个因素，每个因素3个水平，按L9（34）正交表安排实验。以3，4-二羟基苯甲酸甲酯的含量为考察指标，对正交实验的结果进行直观和方差分析。最后确定提取方法为：取白花蛇舌草药材粉末3 g，精密称定，加15倍量90%乙醇，加热回流提取3次，0.5 h/次。
表1 不同来源白花蛇舌草药材中3，4-二羟基苯甲酸甲酯的含量（略）
3.2 流动相的选择 对甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液 2个流动相系统进行了研究。结果表明，甲醇-水作流动相时组分色谱峰较宽，柱效低；以甲醇-0.05%磷酸水溶液为流动相，组分色谱峰峰形好，柱效高，分离效能高。
3.3 结果分析 有关白花蛇舌草中化学成分的分析与测定大部分是针对其中有效成分齐墩果酸及熊果酸。本实验首次建立了测定白花蛇舌草中3，4-二羟基苯甲酸甲酯含量的HPLC法。方法简便、准确，重复性好，可以为白花蛇舌草药材的质量控制提供依据。测定结果表明，8个产地药材中3，4-二羟基苯甲酸甲酯的含量范围在42.2～87.0 μg·g-1范围内。
【参考文献】
［1］ 斯建勇，陈迪华，潘瑞乐，等.白花蛇舌草的化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2006，18（6）：942.
［2］ 谭宁华，王双明，杨亚滨，等. 白花蛇舌草的抗肿瘤活性和初步化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2002，14 (5) ：33.
［3］ Lu C M ,Yang J J ,Wang P Y,et al. A new acylated flavonol glycoside and antioxidant effect of Hedyotis diffusa［J］.Planta Med ,2000 ,66 :374.
［4］ 解军波，李 萍．四季青酚酸类化学成分研究［J］.中国药科大学学报，2004，35(3)：205.