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【摘要】目的 研究建立连钱草高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法，为其质量控制和药材鉴别提供依据。方法利用高效液相色谱法，采用反相Symmetry C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈和0.4%磷酸溶液（梯度洗脱）；检测波长327 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min。进样体积20 μl。结果在选定的色谱条件下确定18个峰构成连钱草药材的指纹特征,各批次药材均具有上述特征,但特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异。确定了连钱草药材HPLC 中绿原酸、木犀草素二个黄酮成分所对应的保留时间一致;10个批次的连钱草药材HPLC 指纹图谱相似度均大于0.93。结论该方法准确、简单、稳定，其色谱指纹图谱可用于连钱草的鉴别和质量控制。
【关键词】 Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint of Herba Glechomae.MethodsThe HPLC method was used,and the chromatography conditions were Symmetry C18 column(250 mm ×4.6 mm,5μm) with mobile phase of acetonitrile--0.4% phosphoric acid dihydrogen phosphate solution of water ; the UV detection wavelength was 327 nm and column temperature was 30℃with the flow rate of 1.0 ml/min;the injection volume was 20μl. ResultsIn this chromatography condition,eighteen peaks were identified as the characteristic fingerprints of Herba Glechomae. All samples tested contained the same eighteen peaks,but the content of each peak showed great difference among the samples,which resulted in the differences in their chromatograms.The retention time of Caffeotannic acid and luteolin in Herba Glechomae were determined. The fingerprint showed high similarity in samples from different habitats. ConclusionThe method is exact,simple and accurate, and can be used for the identification and quality control of Herba Glechomae.
Key words：Herba Glechomae; Fingerprint; HPLC
连钱草为唇形科活血丹属植物活血丹Glechoma longituba (NaKai)Kupr．的干燥地上部分，为《中国药典》(2005年版)Ⅰ部收载品种。该植物除西北部地区外，我国大部分地区有分布，尤以江苏产量大，质量优，为江苏产地道药材。因其具有利湿通淋、清热解毒、散淤消肿之功效，用于热淋、石淋、湿热黄疸等疾病的治疗［1］，习称为“苏金钱”“金钱草”，入药配方或作为中药制药的原料。文献报道连钱草含有黄酮类、三萜类以及挥发油、无机盐等化学成分［2，3］。药理研究表明，连钱草水煎剂具有显著的利尿作用，并有利胆、溶解结石作用。抑菌实验表明，连钱草对金黄色葡萄球菌极度敏感，对痢疾杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌中度敏感［4］。连钱草的化学成分研究表明其含有丰富的黄酮。本文采用HPLC-PDA检测器检测技术对连钱草脱脂后用有机溶剂提取的连钱草药材中绿原酸、木犀草素黄酮类成分首次建立HPLC指纹图谱，不同批次的HPLC 指纹图谱有很大的相似。 本实验就连钱草黄酮类HPLC指纹图谱分析方法建立为连钱草药材质量控制提供科学依据。
中药指纹图谱技术作为一种多组分复杂样品的有效质量控制方法，能够反映出待测样品的整体性、特征性，在中药的药材鉴别、生产工艺、药效部位筛选、质量控制等方面的研究中应用广泛［5］。本文采用高效液相色谱法，研究并建立连钱草指纹图谱，并对绿原酸、木犀草素黄酮成分用HPLC 法进行了较系统的研究，以期为连钱草的质量控制建立有效的方法,并为连钱草的临床用药提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版，Mettler万分之一，十万分之一电子天平，Milli-Q纯水器。
1.2 材料 试剂：DikmaPure乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司），其它试剂均为分析纯。对照品：木犀草素由（江苏省中医药研究院化学研究室提供）纯度达98%以上；绿原酸标准品由中国生物药品鉴定所提供；药材来源：江苏省盱眙县。
2 方法
2.1 色谱条件 色谱柱为Symmetry C18柱 (4.6 mm×250 mm，5μm)；检测波长327 nm；柱温30℃； 流动相为（A）乙腈和（B）0.4%磷酸溶液，（12∶88）梯度洗脱，运行时间90 min。1～70 min乙腈从12%线性梯度至76%；70～75 min线性梯度至12%；75～90 min线性梯度至12%。流速：1.0 ml/min；进样量20 μl。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸，木犀草素对照品适量分别用甲醇溶解稀释并定容，得对照品溶液,浓度分别为绿原酸45.5 μg/ml，木犀草素0.146 mg/ml，再分别精密吸取1 ml，置5 ml容量瓶中，加甲醇稀释致刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 精密称取连钱草细粉约2.5 g置索氏提取器中，加入乙醚100 ml，水浴回流至无色，回收乙醚，将药渣中乙醚挥干，继用80 ml甲醇提取至无色，放冷，移至100 ml容量瓶内，并用甲醇定容至刻度，摇匀，取上清液经0.45 μm 微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
3 结果
3.1 图谱测定时间的确定 取样品溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，按选定的梯度洗脱，记录90 min内色谱图，结果表明60 min 后无有意义峰出现，故确定图谱记录时间90 min。
3.2 精密度实验 精密称取连钱草1号样品细粉2.5 g，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，连续重复进样6次，记录指纹图谱。考察各共有峰相对保留时间及相对峰面积比值的一致性，结果显示各共有峰相对保留时间RSD为0.01%～0.35%，相对峰面积的RSD为0.36%～2.49%，符合指纹图谱研究技术的要求［5］。
3.3 重复性实验 精密称取连钱草2号样品细粉6份，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，进行测定，考察各共有峰相对保留时间及相对峰面积比值的一致性，各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.14%，相对峰面积的RSD为0.28%～2.83%，符合指纹图谱研究技术的要求［6］。
3.4 样品指纹图谱测定 分别取不同批次连钱草样品10个，按供试品溶液的制备方法获得供试溶液，测定，通过10批连钱草样品的指纹图谱的测定，比较其色谱图，确定共有峰18个，相对保留时间、相对峰面积见表1～2。色谱图结果见图1～2（峰4为绿原酸峰，15号峰为木犀草素）。
表1 样品相对保留时间 （略）
表2 样品相对峰面积（略）
图1 连钱草样品HPLC指纹图谱（略）
图2 10批连钱草药材指纹图谱（略）
3.5 相似度计算 运用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版对10批连钱草药材的指纹图谱进行相似度分析，首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述18个特征峰进行谱峰匹配，通过中位数矢量计算得出连钱草样品指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为标准，进行整体相似度评价，相似度评价结果均大于0.92，说明这10批连钱草药材的化学成分一致性较好。结果见表3。
表3 样品指纹图谱相似度分析结果（略）
4 讨论
4.1 提取溶剂与提取方法的选择 在供试品溶液制备条件选择上，脱脂溶剂曾采用乙醚、氯仿、等溶剂进行脱脂, 以乙醚溶液脱脂效果较好,在提取溶剂选择上，比较了甲醇、乙醇、丙酮做提取溶剂试验，结果表明样品用甲醇为溶剂，提取比较完全。在提取方法的选择上，用甲醇作溶剂, 对比回流提取、索氏与超声提取3种提取方法，三者HPLC图谱基本一致，但是从主要色谱峰的积分面积和杂质干扰上可见索氏提取的效率明显高于超声、与回流提取，因此选择采用索氏提取法。
4.2 流动相的选择 在流动相的选择实验过程中，最初采用的甲醇-水，乙腈-水，乙腈-甲醇-水，乙腈-0.4%磷酸二氢钾溶液（50∶50）等度流动相未得到满意的分离效果，然后又选择了甲醇-0.5%磷酸二氢钾溶液以及乙腈-0.4%磷酸溶液等多种不同流动相、不同梯度的流动相体系，最终确定以本实验现在采用的乙腈-0.4%磷酸溶液（12∶88）梯度流动相体系各成分分离效果最佳。
4.3 检测波长的选择 本实验用二极管阵列检测器，在200～400 nm 范围内进行光谱扫描，提取连钱草黄酮苷等的色谱峰光谱图，在325～341 nm 处有最大吸收，综合多个成分考虑，故选取327 nm 作为连钱草指纹图谱的检测波长，以提高检测的灵敏度，提高分析方法的准确性和可靠性。
4.4 共有峰的确定 对不同供试品所得指纹图谱进行分析，选择稳定性较好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰共标定了18个峰。其中峰4为绿原酸，峰15为木犀草素。木犀草素峰较大，分离度及峰型都很好，因此选择15号峰为参考峰，计算各特征峰的相对保留时间，和相对峰面积。每批样品均有18个色谱峰，除已标定的色谱峰外，还有一些不太明显的共有峰及每批样品各自特有的色谱峰，可作为测定特定类型连钱草的指标。
4.5 方法评价 连钱草的化学成分研究表明其含有丰富的黄酮。本文采用HPLC-PDA检测器检测，优化色谱条件，供试液原液过滤后直接进样，建立连钱草药材中绿原酸、木犀草素的测定方法，目前连钱草的研究多为黄酮苷含量测定,没有一篇关于连钱草黄酮苷HPLC指纹图谱的完整研究。本实验采用绿原酸、木犀草素黄酮苷成分的HPLC指纹图谱进行了研究。通过指纹图谱可以比较全面地反映连钱草药材的化学成分以及各特征性有效成分间峰面积的相对比例，进而反映连钱草药材的内在质量，为连钱草药材判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性提供依据。本实验中所建立的测定方法快速准确，灵敏度高，可作为连钱草质量控制和应用的依据以及中药研究的方法学借鉴。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：117.
［2］ 中华本草编委会.中华本草［M］.上海：上海科技技术出版社，1998：6058.
［3］ 王 庆，段金廒，钱大玮，等.不同产地连钱草中三萜酸类及黄酮类化学成分析与评价［J］.南京中医药大学学报，2006，22 （1）：44.
［4］ 杨念云，段金廒，李 萍，等.连钱草中的总黄酮类化学成分［J］.中国药科大学学报，2005，36 （3）：210.
［5］ 刘小瑜，吕圭源，俞景华. 指纹图谱在中药研究中的应用概况［J］.天津药学，2006，18(1)：46.
［6］ 国家药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》的通知［J］.中成药，2000，22(10)：671.