高效液相色谱法测定空心莲子草中穆坪马兜铃酰胺的含量

　　【摘要】 　　目的建立空心莲子草中穆坪马兜铃酰胺的含量测定方法。方法采用HPLC法定量分析空心莲子草中穆坪马兜铃酰胺的含量，色谱柱为Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈－水（25∶75）为流动相，检测波长220 nm，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃。结果穆坪马兜铃酰胺进样量在0.054 1～1.080 2 μg范围内线性关系良好，线性回归方程为Y=6 965.4X－2 148.5，r=0.999 7；平均回收率为101.9％，RSD=2.67%。结论该方法简便易行,准确可靠。

　　【关键词】  空心莲子草 穆坪马兜铃酰胺 高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish a determination method of the content of N-trans-feruloyl tyramine in Alternanthera philoxerodes. MethodsThe content of N-trans-feruloyl tyramine in Alternanthera philoxerodes was determined by HPLC and Alltima C18 column (250 mm×4.6 mm，5μm) was used .The mobile phase was a mixture of  acetonitrile - water (25∶75),column temperature was 30℃, the flow rate was 1 ml·min-1 and the detection wavelength was 220 nm . ResultsThe calibration curve of N-trans-feruloyl tyramine was linear over the range of 0.054 1～1.0802 μg ,and the equation of linear regression was Y=696 5.4X－2 148.5 (r=0.999 7).The average recovery rate was 101.9%(RSD=2.67%).ConclusionThe methed is simple and the result is accurate.

　　Key words：Alternanthera philoxerodes；   N-trans-feruloyl tyramine；  HPLC

　　空心莲子草Alternanthera philoxerodes （Mart.）Griseb为苋科莲子草属（Alternanthera）多年生宿根草本植物，又名空心苋、螃蜞菊、水花生等［1］。曾收载于《中国药典》Ⅰ部（1997年版），具有清热解毒、凉血利尿的功效。现代药理研究表明，空心莲子草具有抗流感病毒［2］、抗流行性出血性热病毒［3］、抗乙型肝炎病毒等［4］多种抗病毒药理作用。本实验室从空心莲子草中提取分离得到的生物碱类成分穆坪马兜铃酰胺具有明显的抗乙肝病毒药理活性(药理研究由武汉大学生命科学院病毒学教育部重点实验室协助完成),故对其进行含量分析研究,对今后评价及控制空心莲子草药材质量具有重要意义。

　　1  仪器与试药

　　Agilent 1100高效液相色谱仪（G1311A泵，G1316A紫外检测仪）；BP-211D型十万分之一分析天平；万分之一分析天平(METTLER TOLEDO AL204)。

　　穆坪马兜铃酰胺（本实验室自制,HPLC法测定其纯度98％以上）供含量测定用；空心莲子草分别采自湖北、湖南、江苏、江西、福建5省，经湖北中医学院中药鉴定教研室吴和珍副教授鉴定为苋科莲子草属植物空心莲子草。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为Alltech alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈－水（25∶75）；流速1.0 ml·min-1；检测波长220 nm；柱温30℃；进样量1～20 μl；理论塔板数应不低于5 000。见图1。

　　2.2  对照品溶液的制备

　　精密称取穆坪马兜铃酰胺对照品1.35 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.3   供试品溶液的制备

　　取空心莲子草粉末（过4号筛）10 g，精密称定置于锥形瓶中，加入甲醇溶液100 ml精密称重，浸渍1 h后，40℃超声提取提取30 min，室温静置20 min，再称定其重量，用甲醇溶液补足失重，摇匀，静置后滤过，取续滤液75ml置于蒸发皿中，水浴加热挥去甲醇，量取蒸馏水20 ml溶解，转移至分液漏斗中，先以石油醚萃取3次（50，50，40 ml），弃去石油醚液，水液再加入醋酸乙酯萃取3次（50，50，40 ml），弃去水液，合并醋酸乙酯液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至 10 ml， 0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

　　2.4  线性关系

　　考察精密吸取对照品溶液1，5，10，15，20μl，进样，按上述色谱条件测定峰面积。以穆坪马兜铃酰胺面积为纵坐标，进样量为横坐标进行线性回归，其回归方程为：Y=6 965.4X－2 148.5，r= 0.999 7,线性范围为0.054 1～1.080 2 μg。见图2。

　　2.5   精密度实验

　　精密吸取上述对照品溶液10 μl，连续进样5次，测定峰面积，峰面积平均值为3.389 9×103，RSD值为1.17％（n =5），表明仪器精密度良好。实验结果见表1。表1  精密度实验结果（略）

　　2.6  稳定性实验

　　取同一份供试品溶液，在0，2，4，6，8，12 h进行测定，峰面积平均值为2.269 1×103，RSD值为1.71％，表明供试品溶液至少在配制后12 h内测定，穆坪马兜铃酰胺含量稳定，结果见表2。表2  稳定性实验结果（略）

　　2.7  重复性实验

　　取同一批样品共6份，每份约10g，按“供试品溶液的制备”项下所述方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件测定并计算峰面积平均值为3.788 6×103，RSD值为2.15％（n=6），表明方法重复性良好。结果见表3。表3  重复性实验结果（略）

　　2.8  加样回收率实验

　　取已知含量的同一批样品共6份，每份10 g，精密称定，分别加入适量对照品，按“供试品溶液的制备”项下所述方法制备成供试品溶液，测定并计算穆坪马兜铃酰胺的含量，平均加样回收率为101.9％，RSD值为2.67％（n =6）。结果见表4。表4  加样回收率实验结果（略）

　　2.9  样品测定

　　精密称取空心莲子草样品粉末（过4号筛）约10 g，按“供试品溶液的制备”项下所述方法进行制备，取供试品溶液20 μl进样，测定并计算不同产地陆生与水生的穆坪马兜铃酰胺含量结果见表5。表5  不同产地陆生与水生的穆坪马兜铃酰胺含量（略）

　　3  讨论

　　采用高效液相色谱法测定空心莲子草中穆坪马兜铃酰胺的含量，方法稳定，重复性好,杂质干扰少,适合空心莲子草中穆坪马兜铃酰胺的含量测定。

　　从上述5个产地空心莲子草的含量测定结果可以看出,空心莲子草中穆坪马兜铃酰胺的含量不高,且不同产地之间含量差异明显,同一产地水生含量大于陆生含量,由此可以看出,空心莲子草的品质受地域及生态环境的影响很大。

　　【参考文献】

　　［1］国家药典编委会.中国药典［S］.北京：人民卫生出版社，1977：376.

　　［2］邓麟瑞,朱景玉，徐惠堂，等.空心莲子草抑制流感病毒的实验研究［J］.中华微生物和免疫杂志，1984，4（3）：172.

　　［3］曲春枫，杨占秋，向近敏.空心莲子草有效部位对流行性出血热病毒感染乳鼠的保护作用［J］.中国中药杂志，1993，18（5）：304.

　　［4］熊舜华，程化奇，黄天蓉，等．螃蜞菊对乙型肝炎患者染色体及GPT、HBsAg聚细胞改变的观察［J］.湖北医学院学报，1986，7（2）：140.