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气相色谱-串联质谱法测定血液中乙基葡萄糖醛酸苷

来源:www.sepu.net
摘要:乙醇进入人体后,有一部分乙醇与尿嘧啶核苷-5‵-二磷-葡萄糖醛酸结合成乙基葡萄糖醛酸苷(ethylglucuronide,EtG)由于其比原体乙醇的半衰期长,当血液中乙醇浓度低于检测限时,体内仍可在一定时间内检出EtG。因此血液中EtG的检测及评价越来越为人们所重视,特别是酒后驾车肇事逃逸案件中,抽血与事故发生时间隔过长,......

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    酒后驾车是一个世界性的交通安全问题。我国每年因交通事故死亡中约25%-30%与酒后驾车有关。由于乙醇在体内代谢较快,一般饮酒后6-8h体内已检测不到乙醇。对于疑酒后驾车肇事后逃逸者,在一定时间后体内检测不到乙醇,因此需要寻找新的途径证明肇事者是否为酒后驾车。

    乙醇进入人体后,有一部分乙醇与尿嘧啶核苷-5‵-二磷-葡萄糖醛酸结合成乙基葡萄糖醛酸苷(ethyl glucuronide,EtG)由于其比原体乙醇的半衰期长,当血液中乙醇浓度低于检测限时,体内仍可在一定时间内检出EtG。因此血液中EtG的检测及评价越来越为人们所重视 ,特别是酒后驾车肇事逃逸案件中,抽血与事故发生时间隔过长,血液中往往测不出乙醇成分,但可以检测血液中EtG。

    血液中EtG的测定方法主要有液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用发(GC-MS)。LC-MS/MS是最常用的检测方法。GC-MS测定中杂质干扰较多,对样品前处理要求较高,需要固相萃取,样品处理时间长,而气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)可以克服这些缺点。

    本研究建立了血液用乙腈沉淀蛋白,经衍生化后用GC-MS/MS检测EtG的方法

    1 材料与方法:

    1.1 仪器与试剂

    气相色谱(美国Agilent公司)与Quattro Micro GC 串联质谱(美国Waters公司)联用仪,MiniSpin plus 离心机(美国Eppendorf公司),EtG和EtG-d5(美国Cerilliant公司),N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(BSTFA-TMCS,体积比为99:1)(美国Sigma-Aldrich公司),其余试剂均为分析纯。

    1.2溶液配制

    EtG溶液:将100ug/ml的EtG标准甲醇溶液用甲醇稀释得20.0ug/ml的EtG工作液。 内标EtG-d5工作液。

    1.3样品前处理:

    取血液0.10ml置于1.5ml离心管中,加入5ul内标EtG-d5工作液和0.90ml乙腈,涡旋混合,以离子半径6cm,10000r/min,离心5min,转移上清液至另一离心管中,6cm,10000r/min,离心5min,转移上清液至另一离心管中,60℃水浴中空气流下吹干,残留物中加入BSTFA-TMCS(66ul)和吡啶(33ul),90℃干燥箱中进行衍生化反应30min,取出。冷却后1ul进样。

    1.4仪器分析:

    1.4.1气相色谱柱条件

    色谱柱:HP-1MS毛细管柱(30mX0.25mm,0.1um)。柱温:初温100℃保持1min,以8℃/min程序升温至205℃,再以30℃/min程序升温至280℃保持3min。进样口温度: 250℃。分流比为10:1.载气:氦气,流速为1ml/min。

    1.4.2质谱条件

    离子源(EI源)温度220℃,接口温度300℃,碰撞气为氩气。正离子多反应监测模式检测,MRM定性离子对:EtG 为261>143(CE=5),261>73(CE=20);EtG-d5为266>143(CE=5),266>73(CE=20);以261>143(EtG)和266>143(EtG-d5)作为定量离子对。

    2 案例应用:

    某司机于某日上午7:00许发生交通事故后,驾车逃离现场,当日晚21:00许投案。静脉抽血送检,其时距交通肇事时间为14h,结果未检出乙醇成分。应用本方法分析,结果检出EtG成分,为委托单位办案提供了有力的证据。

    3 结论

    本研究院建立了一种有机溶剂沉淀蛋白,经衍生化后,用GC-MS/MS检测血液中EtG的方法,并成功应用于案例。该方法简便、快速,适用于实际检案工作。

作者: 2010-5-13
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