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中药有效成分的分析有其特殊的复杂性, 首先是中药品种繁多, 不同品种间活性成分的含量相差悬殊; 其次中药有效成分受产地、栽培、生长环境和采收季节等多种因素的影响。
目前用于中药成分分析的方法很多, 其中HPLC 最常用。但用HPLC 进行中药成分分析常遇到一些问题,一是分析时间长、分离效率低, 即使采用梯度洗脱技术也难以使某些成分完全分离; 二是由于中药成分复杂, 色谱柱容易被污染, 而且污染后难于清洗, 使柱的使用寿命缩短, 且难以再生; 三是色谱柱上沉积的污染物, 经常以杂质峰的形式出现; 四是分析运营成本高; 五是对于含极性成分较多的中药, 其“指纹”的特征不强。
高效毛细管电泳( high performance capillary electrophoresis,HPCE) 又称毛细管电泳, 是近十几年来发展很快的一种高效分离分析技术。它以高压电场为驱动力, 毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异实现分离的一类液相分离技术, 具有分离效率高、速度快、灵敏度高、所需样品少、溶剂消耗少、成本低且毛细管柱的费用远低于高效液相的分析柱、前处理简单、抗污染能力强、应用范围广等特点。下面简要介绍一下高效毛细管电泳在中药材鉴别中的应用。
1 中药及其炮制品鉴定中的应用
许重远等[3]用酸性、碱性、中性3 种提取液采取HPCE 技术对生药狗脊、制狗脊及其混淆品黑狗脊进行检测, 实验结果证明其电泳图谱存在显著差异, 并可利用酸性提取液的图谱将生狗脊与制狗脊加以鉴别。
2 种子类药材鉴定中的应用
陈振德等[4]对国产榧属植物种子蛋白进行了HPCE分析, 电泳图谱区分了榧子、云南榧子、巴山榧子、香榧子、九龙山榧子、长叶榧子、日本榧子等, 差异明显,可作为中药榧子的鉴别方法之一。陈振德等[5]还对酸枣仁及其混淆品同科植物滇枣仁( 又称理枣仁) 和枳具子进行HPCE 法鉴别。从应用HPCE 对酸枣仁及其混淆品酸枣仁蛋白多肽检测结果看, 酸枣仁与其混淆品之间有明显的差异, 可有效地加以区分; 同时, 本法需要的样品少, 操作简单、重现性好, HPCE 作为酸枣仁的鉴别方法被证明是科学、可行的。胡平等[6]对中药菟丝子( 旋花科植物, Cuscuta chinensis Lam) 及其混淆品金灯藤, 南方菟丝子应用HPCE 法进行了生药鉴别。实验表明, 同属不同种菟丝子的碱溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有显著差异。结果与运用扫描电镜和显微镜鉴别的结果一致, 可有效鉴别菟丝子来源。婆罗子为多来源的生药, 性状很难鉴别, 张新等[7]采用HPCE- 聚类分析法对不同产地不同原植物的生药婆罗子进行了有效鉴别。贾江滨等[8]对乌梅及其混淆品李子的蛋白多肽进行了HPCE 法鉴别。结果发现, 在酸性、碱性和中性蛋白提取液中乌梅和李子的HPCE图谱都存在明显差异。宋贤丽等[9]利用HPCE 法鉴别了6 种决明属的药用植物种子, 分别采用毛细管区带电泳( CZE) 和毛细管胶束电动色谱( MECC) 两种模式来进行电泳, 电压分别选择20、22、25、30kV, 在200、214、220、235、245、500nm 处进行检测。不同来源钝叶决明的电泳结果显示, 采集时间和地点的不同对峰数目和峰面积影响较小, 因此, 利用HPCE 鉴别决明类种子具有可行性。
3 根茎类药材鉴定中的应用
李玉琪等[10]利用HPCE 法以赤土茯苓苷为土茯苓的标志性成分, 选择毛细管胶束电动色谱( MECC) 分离模式对土茯苓( 百合科菝葜属植物光叶菝葜的干燥茎) 及其6 种混用品进行了鉴别。分析样品均为各药材粉末的醇提液经过0.45μm 滤膜过滤后直接进样,10min 即可完成, 验证了高效毛血管电泳具有样品处理简单、操作简便、分析快速等特点。该方法用于赤土茯苓苷的含量测定, 也得到了准确的结果,而且其检测限很低( 0.4μg/mL) 。侯连兵等[11]对三七及其混淆品菊叶三七的蛋白多肽进行了HPCE 法的鉴别, 在酸性、碱性和中性提取液中三七及其混淆品都存在明显差异。
4 花、叶及果实类药材鉴定中的应用
西红花是名贵中药以鸢尾科番红花的柱头入药。红花为菊科植物, 头状花序入药, 有时充当番红花销售。马晓强等[12]对西红花和红花及伪品萱草和黄花菜应用HPCE 法对其水溶性成分进行了定性分析, 西红花、红花、萱草和黄花菜四种“红花”的毛细管电泳图谱显示了很大程度的不同。该方法速度快、灵敏度高、重现性好, 可作为红花类药材的定性鉴别方法。谢立等[13]对龙眼肉及其混淆品荔枝肉的蛋白多肽应用HPCE 法进行了鉴别。陈志良等[14]对宁夏枸杞和枸杞的果实蛋白应用HPCE 法进行了鉴别, 从检测结果看, 两者在4.0min~12.0min 区间具有相同的主要特征吸收峰。同时, 两者在3 种提取液中又有各自的特征吸收峰, 两者之间有明显的差异, 可有效地加以区分。王寅等[15]以HPCE 法对不同属群大青叶药材的理化特征差异进行研究, 结果表明异地栽培的不同属群大青叶酸性提取部位的化学成分及含量有显著差别, 依据电泳图谱中特征峰的迁移时间和峰面积, 能有效鉴别不同属群的大青叶药材。
5 中药有效成分测定中的应用
HPCE 法可用于多种有效成分的分离和含量测定, 如生物碱、黄酮类、苷类、有机酸类、醌类、酚类、香豆素类等。姜舜尧等[16]采用HPCE 以多潘立酮为内标,运行缓冲液为甲醇: 20.6mol/L Tris 溶液( 1: 1) , pH6.0,其中含10mmol/L 庚烷磺酸钠, 电压20kV, 检测波长200nm, 对夏天无药材中的成分进行分离研究, 分析了原阿片碱和延胡索乙素的适宜分离条件, 并测定了其中延胡索乙素的含量。赵霞等[17]用内标法分析了9 种贝母药材中浙贝乙素、西贝素、西贝苷等生物碱的含量。
6 中药制剂生产质量控制中的应用
中药制剂成分复杂, 目前其质量控制的方法多是测定其中一种或几种指标成分的含量, 但这种方法不能完全体现出中药制剂的整体质量, 在尚不清楚全体化学成分的情况下,现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得物质群指纹图谱展现了这种可能性。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的手段。
许重远等[18]建立了甘草栓中甘草酸、甘草次酸的HPCE 法, 为中药甘草制剂的质量控制提供新的检测方法。尹茶等[19]建立了同时测定银翘解毒片中绿原酸甘草酸和甘草次酸的HPCE 法, 结果表明, HPCE 能在10min 内完成银翘解毒片中3 种有效成分的测定, 灵敏度高, 适于中成药中多种有效成分的同时测定。史国兵等[20]考察了四种不同柞蚕蛾提取物的九如天宝液与市售九如天宝液的HPCE 指纹图谱的差异, 认为图谱特征明显、专属性强, 为鉴别该药物的真伪提供了科学依据。陈玉英等[21]采用HPCE 法测定了10 批供试样品的HPCE 指纹图谱, 建立相关的栀子药材的指纹图谱, 并对该方法学进行考察, 结果符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) 》中有关规定, 可作为控制含栀子等中药制剂内在质量的方法。梁统等[22]用MECC 测定了补骨胶囊中淫羊藿苷的含量, 并比较了由 SDS及脱氧胆酸钠分别组成的电泳缓冲液对分离淫羊藿及其复方制剂中淫羊藿苷的影响, 结论为由于杂质对毛细管柱寿命无影响, 分辨能力强, 能较好地把淫羊藿苷与干扰物分离, 精密度高, 有机溶剂消耗少, 测定成本低, 在中药有效成分的分离检测中显示了较好前景。闫滨等[23]测定了克心痛滴丸中阿魏酸的含量, 结果表明HPCE 法分离测定阿魏酸操作简便, 进样量小,分离完全, 峰形正常。线性范围较宽, 重现性好, 为中药制剂中阿魏酸的质量控制提供了新的实验手段。并从电泳图谱发现, 克心痛滴丸中各组分均有良好的基线分离, 提示对于其他组分定量分析的可能性。陈勇川等[24]在用HPCE 法测定刺五加注射液中槲皮素的含量中, 考察了缓冲液的pH 值、浓度对样品分离的影响。结果发现, 缓冲液pH 为8.5 时, 运行缓冲液为50mmol/L硼酸缓冲液, 槲皮素有较好的分离效果, 为刺五加注射液中有效化学成分的定量提供了一条新的途径。陈勇川等[25]用HPCE 法测定了八珍丸和八珍益母丸中芍药苷的含量, 结果表明定量是准确有效的, 与HPLC 法测定结果基本一致。《中国药典》( 2000 年版) 一部中将HPLC 法作为八珍丸中芍药苷定量的方法, 要求理论塔板数不低于2000, 而本实验中用HPCE 法的理论塔板数可达到100000 以上, 分离效率大大高于HPLC法。经方法学考察, 本法精密度高、稳定性和重现性好。于燕莉等[26]用HPCE 法测定了痹痛宁贴剂中东莨菪碱及乌头碱的含量。由于生物碱类药物的碱性强,极性大, 采用HPLC 分析时, 往往被色谱柱吸附太强,造成峰形不好, 易拖尾。虽然可通过改善流动相介质取得一定效果, 但常用的离子对试剂对色谱柱污染极大。采用HPCE 法测定痹痛宁贴剂中2 种生物碱的含量, 具有分离效果好, 可不经富集直接检测, 操作简便快速的优点, 4min 即可得到电泳图谱。郭丹等[27]在用HPCE 法测定生发灵酊中阿魏酸和大黄酸的含量时发现: 毛细管易冲洗再生, 可保持高效, 使各成分的分离较佳, 并通过研究揭示了缓冲液浓度和pH 值对分离具有重要影响, 选择30mmol/L 硼砂( pH8.2) 作为运行缓冲液。
7 结语
高效毛细管电泳以其高效、快速、简便且柱不易受污染的特点而优于HPLC 法, 在中药有效成分的分离、定性定量、中药材鉴别等方面应用越来越广泛, 但目前仍存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等缺陷。随着商品仪器不断改进和完善, 加上自动进样器的普遍使用, 基本可以克服重现性差的缺陷, 与常规HPLC 法接近; 灵敏度低可通过在柱预浓缩, 如场放大堆积效应, 或经浓缩预处理, 如固相萃取等技术加以改善。此外, HPCE 法可与其他进样技术如流动注射联用, 不但可提高测定精度, 而且能完成连续自动进样及在线分析, 方便大批量样品的测定, 或采用CE-MS、CE- NMR 及CE-MS-MS 的联用技术, 充分利用HPCE的高分离效率和MS 或NMR 的高灵敏度与定性鉴定能力, 快速完成众多复杂成分的分离与结构鉴定, 大大提高和拓宽CE 的性能和应用范围, 更适用于中药复杂化学成分的分离与测定。