中药侧柏叶黄酮成分指纹图谱分析方法的研究中药指纹图谱 | 39康复网

摘要：目的：研究建立侧柏叶药材指纹图谱分析方法，提高侧柏叶质量标准。方法：选择Dimonsil C18色谱柱（5um，250mm×4.6mm），以甲醇-含1%冰醋酸的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相，检测波长254nm，用梯度洗脱绘制侧柏叶总黄酮成分的指纹图谱。流动相梯度：流动相A与B比例由15:85(0～55min)→85:55(55～60min) →15:85，流速：0.8ml/min。结果：建立了侧柏叶药材黄酮成分的指纹图谱分析方法，通过方法学考察证实了本法的可行性。结论：本研究建立的侧柏叶黄酮指纹图谱分析方法，可用于鉴别侧柏叶药材、果实、侧柏枝以及炮制品侧柏炭。
关键词:侧柏叶,总黄酮, 指纹图谱,分析
    侧柏叶药材为柏科植物侧柏Platucladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢及叶［1］。全国大部分地区有分布，且现广泛栽培。侧柏叶性寒，味苦、涩，对其药理的研究主要有止咳祛痰作用与抗菌、抗病毒作用的报道［2,3］。侧柏叶主要含挥发油及黄酮类成分［2,4］。叶中的总黄酮成分含量为1.7%［3］，其中以槲皮苷为主。槲皮苷为槲皮素的-3-O鼠李糖苷，对槲皮苷及其苷元的分析研究，从单纯的HPLC法含量测定，到HPLC-NMR-MS分析研究均有报道［5，6］。中国药典2000年版一部侧柏叶项下规定以高效液相色谱法测定其槲皮苷的含量，限度仅为“不得少于0.1%”，可见尚有较多的黄酮类成分未加以控制。作者以提高侧柏叶质量标准，促进优质中药材规范化生产体系建立，并为2005年中国药典的修订提供参考为目的，对侧柏叶的标准物质与质量标准进行了进一步的研究，比较了侧柏叶、枝、果实（珠鳞）以及侧柏炭中的黄酮成分。研究建立了指纹图谱分析方法，并初步探索了适合于中药指纹图谱分析方法研究的方法学考察思路。
1 仪器与试药
    Waters 2690 HPLC Separations Module, Waters 996 Photodiode Array Detector;Millennium32 Workstation。瑞士BUCHI公司旋转蒸发仪。色谱柱：DikmaDiamonsilTM C18（ 5um，250mm×4.6mm）。
    对照品：槲皮素为中国药品生物制品检定所对照品，槲皮苷自制，经结构鉴定并测定纯度为98.8%；流动相甲醇为色谱纯，醋酸、磷酸二氢钾等均为分析纯。
    样品1：2000年9月底采自河南省鲁山县昭平台水库。阴干后，摘去果实、硬枝，粉碎备用。
    样品2：2000年9月底采自河南省鲁山县昭平台水库，阴干后，仅选择叶部分粉碎备用。
    样品3：2000年9月底采自河南省鲁山县昭平台水库，阴干后，仅选择枝部分粉碎备用。
    样品4：2000年9月底采自河南省鲁山县昭平台水库，阴干后，仅选择果鳞部分粉碎备用。
    样品5：2000年9月月底采自河南省鲁山县四棵树村，阴干后，仅选择枝部分粉碎备用。
    样品6：2000年9月底采自河南省鲁山县四棵
树村，阴干后，仅选择叶部分粉碎备用。
    样品7：2000年9月下旬购自亳州药市，外观陈旧，呈棕褐色，粉碎备用。
    样品8：2000年9月下旬购自杭州药店，外观陈旧，呈棕黄色，粉碎备用。
    样品9：2000年11月购自云南省昆明市菊花园药市，外观陈旧，呈黄绿色，粉碎备用。
    样品10：2000年11月购自安国药市，外观陈旧，呈棕黄色，粉碎备用。
    样品11：侧柏炭，2000年11月购自安国药市，呈黑色，粉碎备用。
    以上各样品由河南省药品检验所中药室雷留成主任药师和中国药品生物制品检定所中药室张继副主任药师鉴定。
2分析条件的确立
2.1对照品溶液的制备:精密称取槲皮苷、槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1ml均含0.1mg的混合对照品溶液。称取槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的对照物溶液。
2.2供试品溶液的制备:称取侧柏叶粉末1g，加甲醇25ml，浸泡过夜。超声提取30min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。并同时做试剂空白。
2.3色谱条件的确立:吸取上述3种溶液各10ul进样。以不同梯度乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸、甲醇-水、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液等分别试验，最终选择出下述色谱条件作为指纹图谱分析条件：甲醇（A）-含1%冰醋酸的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（B）为流动相，按表1设定梯度洗脱，检测波长：254nm。该条件下所得侧柏叶（样品1）指纹图谱中有12个（组）共有峰（图1-B）.
3方法学考察
3.1精密度：
    精密吸取对照品溶液20ul进样，按上述色谱条件测定6次，计算色谱峰的理论板数、分离度，结果如下：以槲皮苷色谱峰计理论板数平均值为64.339，RSD为2.5%(n=6)，以槲皮素色谱峰计理论板数平均值为68.417，RSD为3.8%(n=6)；两峰分离度平均值为7.2，RSD为1.8%(n=6)。
3.2重复性
    精密称取侧柏叶（样品1）6份，按上述供试品溶液制备方法操作，取供试品溶液20ul进样测定，以样品中槲皮苷峰为参照，计算6次试验测得指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积及RSD。结果显示，除7号峰含量低且与相邻峰分离度小，相对峰面积标准偏差较大外，其它峰的RSD均在2.6%以下。见表2。(略)
4不同样品指纹图谱的比较
    取不同样品粉末，按上述方法、条件试验，绘制图谱。分别以图谱中槲皮苷色谱峰为参照峰，计算各样品指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。从11个样品指纹图谱分析结果可见，除侧柏炭（样品11）外，其它样品均有12个共有峰，且相对保留时间一致，但样品不同相对峰面积相差较大。
5讨论
5.1本研究采用梯度洗脱方法，与常用定比例流动相洗脱方法相比较，影响因素较多，虽连续6次试验测定的精密度、重复性结果均较佳，但作为规定该方法的系统适应性的依据，还须权衡色谱柱的新旧程度、不同厂家生产的同类色谱柱的差异等影响。为此在连续2个月的指纹图谱试验过程中，间隔注入混合对照品溶液，并更换色谱柱（Alletch Alltima C18,5um,150mm×4.6mm），记录色谱图，计算各组分色谱峰的理论板数及分离度，结果表明，槲皮苷色谱峰的理论板数在49285至66143之间，槲皮素色谱峰的理论板数在;34017至72084之间，两峰的分离度在4.64至7.39之间。以上结果可为本方法系统适应性相关规定提供参考。
5.2 本研究所用样品中，除老枝（样品3、样品5）、果鳞（样品4）、样品9外，其他各样品指纹图谱具有良好的相似性，其相对保留时间、相对峰面积范围，可作为草拟侧柏叶总黄酮成分指纹图谱分析法的参考数据。
5.3 本文建立的侧柏叶指纹图谱分析方法不同于含量测定的特点在于：选择梯度洗脱以充分分离各组分；规定以2个对照品为系统适应性评价指标，限定各对照品色谱峰的理论板数、各色谱峰间的分离度；并规定参照峰的保留时间范围为（32±2）。

作者： 2006-3-27