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大青叶的毛细管电泳指纹图谱研究

来源:分析化学研究简报
摘要:5kV,以硼酸(100mmol/L):硼砂(50mmol/L)=11∶10(调pH11)为背景电解质进行指纹图谱研究。建立了大青叶药材的电泳指纹图谱(CEFP)。以胞苷峰为参照物峰,确定了18个共有峰,测定了10个产地大青叶的CEFP与共有模式间具有良好的相似性,用色谱指纹图谱指数对其进行评价。所建立的CEFP具有较好的重现性,可用于大青叶......

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摘要:采用高效毛细管电泳法, 紫外检测波长228 nm, 电压12. 5 kV, 以硼酸( 100 mmol/L ) : 硼砂(50 mmol /L) = 11∶10 (调pH 11)为背景电解质进行指纹图谱研究。建立了大青叶药材的电泳指纹图谱(CEFP) 。以胞苷峰为参照物峰,确定了18个共有峰,测定了10个产地大青叶的CEFP与共有模式间具有良好的相似性,用色谱指纹图谱指数对其进行评价。所建立的CEFP具有较好的重现性,可用于大青叶药材的质量控制。
关键词:毛细管电泳,指纹图谱,大青叶,色谱指纹图谱指数,色谱指纹图谱相对指数
 
1 引  言
大青叶( Folium isa tidis)为菘蓝、马蓝和蓼科草本植物廖蓝( Polygonum tinctorium Ait. )的干燥叶,具有清热解毒、凉血消斑等功效[ 1 ] 。大青叶的活性成分有靛蓝、靛玉红、腺苷和色胺酮等。测定大青叶中靛蓝和靛玉红含量有HPLC法和薄层扫描法,未见有毛细管电泳指纹图谱方面的研究。大青叶药材因科属、产地、生长条件、栽培方法、采集时间、贮存条件等不同,使大青叶尽管在化学成分基本相同,但在含量和药理作用方面产生差异[ 2 ] 。本实验用毛细管区带电泳法对大青叶水提取液进行了指纹图谱初步研究,结果具有重现好和稳定的特点,对大青叶药材的质量控制提供了新的参考方法。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
HPCE-10高效毛细管电泳仪和自制重力进样器(大连江申分离科学技术公司) ;数据由江申色谱工
作站记录。分析纯硼砂和硼酸(沈阳化学试剂厂) ;胞苷对照品Cytidin (含量> 99%, Fluka chemie AG,packed in Switzerland) 。
2. 2 样品溶液制备
2. 2. 1 对照品溶液制备:精密称取胞苷对照品10. 0 mg,置于50 mL量瓶中,用水定容至刻度,摇匀即得。
2. 2. 2 样品供试液制备:精密称取于60℃干燥40 min的大青叶药材2. 50 g,加水50 mL,回流提取2 h,过滤,残渣加水30 mL继续回流2 h,合并两次滤液,减压浓缩至10 mL,以80% (V /V )乙醇醇沉24 ,回收乙醇至无醇味,同法进行2次醇沉,最后将样品液定容至25 mL,摇匀,作供试液。
2. 3 电泳条件:石英毛细管65 cm ×75μm i. d. ,有效长度50 cm (河北永年光导纤维厂) ;紫外检测波长228 nm;灵敏度0. 002 AUFS;运行电压12. 5 kV; BGE为硼酸(100 mmol/L) ∶硼砂(50 mmol/L) = 11∶10 (调pH 11) ;重力进样20 s (高度8. 5 cm) 。
3 结果与讨论
3. 1 电泳条件选择
分别以50 mmol/L NaH2 PO4 溶液、50 mmol/L Na2HPO4 和50 mmol/L硼砂及二者混合液作BGE时分析样品,结果良好。考察上述BGE为pH 9. 0、9. 5、10. 0、11. 0和11. 3时, pH 11最理想;当电压为8、10、12. 5, 14和16 kV时,以12. 5 kV分离效果最佳。检测波长为228、254 和280 nm时,以228 nm测得各指纹峰信号较强且大小均匀。
3. 2 药材提取溶剂的选择
分别以95%、70%、50%和25% (V /V )乙醇和水及BGE为溶剂按“2. 2. 2”项制备大青叶供试液,进样分析,发现测得的电泳图差异并不显著,前4种溶剂提取时,常出现溶剂峰;水提取样品时测得电泳图较理想。因此,选水作提取溶剂。
3. 3 大青叶毛细管电泳指纹图谱( CEFP)的建立
3. 3. 1 系统适用性实验和参照物峰的定性
将胞苷对照品溶液和大青叶供试液在毛细管电泳仪上重力进样20 s,毛细管电泳图见图1。对比迁移时间可知6号峰为胞苷。在样品供试液中加入对照品溶液,进样分析,电泳峰增益结果证明上述结论正确。测得胞苷峰的理论塔板数为48397,胞苷峰与相邻峰分离良好,故选作参照物峰。
3. 3. 2 大青叶标准CEFP测定 
将11个产地大青叶供试液在毛细管电泳仪上进样分析2次,记录电泳图。以相对迁移时间和相对峰面积平均值标定其指纹特征。通过对其CEFP比较研究,按各电泳峰的共有率fi ≥70%确定共有指纹峰为18个[ 3 ] (见图1b) , fi =m i/n×100% , mi 为i指纹峰出现产地数, n为总产地数。陕西商洛大青叶CEFP离群,舍弃,取余下10个产地药材各10 g,混匀,精密称取2. 50 g,制备供试液。将供试液进样分析2次,记录电泳图,以迁移时间、相对迁移时间、峰面积和相对峰面积(R. A)标定大青叶CEFP (见表1) ,大青叶标准CEFP见图1b。
3. 3. 3 精密度实验 
将甘肃定西大青叶供试液连续进样5次,记录电泳图,结果各指纹峰的相对迁移时间的RSD均小于3. 5%。相对峰面积除15号峰为6. 2% , 13号峰为6. 4%,其余不大于5. 0%,证明测量精密度满足要求。
3. 3. 4 样品稳定性实验 
取甘肃定西大青叶供试液,分别在制备样品后的0、6、12、18、24及36 h进样测定,记录电泳图。结果各峰相对迁移时间RSD小于4. 8%;相对峰面积RSD在3. 0%~8. 1%之间,表明样品在36 h内稳定。
3. 3. 5 重现性实验 
精密称取10产地大青叶混合药材2. 50 g,按2. 2. 2法制备5份供试液,分别进样测定,记录电泳图。以6号峰为参照物峰,计算18个共有峰相对峰面积RSD值,除15号峰( 8. 2% ) 、16号峰(7. 6% ) 、13号峰(7. 9% ) ,其余不大于5% ,符合指纹图谱要求。
3. 3. 6 不同产地大青叶CEFP与标准CEFP相似性研究 
将3. 3. 2项下测得的各产地CE图谱,以相对峰面积为指标,获得各产地的特征指纹向量Pi = ( y1 , y2 , …., y18 ) , 计算不同产地CEFP与标准CEFP相似度( S)见表2。除了大青叶商洛Ⅰ的S = 0. 87外,其余均大于0. 91,说明不同产地大青叶化学成分是很相似的,宝鸡Ⅱ、Ⅳ和商洛Ⅱ与标准CEFP最相似,而宝鸡Ⅰ和铜川Ⅱ与标准CEFP相似度略小些,商洛Ⅰ大青叶与标准CEFP有显著差异。
3. 4 大青叶色谱指纹图谱指数F 和相对指数Fr[ 4]
孙国祥等[ 4 ]首次提出用色谱指纹图谱指数F和相对指数Fr 评价色谱指纹图谱,其包括3个方面:(1)有效分离率 β=m / ( n - 1) ,其中n为指纹峰数, m 为基线分离(R ≥1. 5)峰对数; (2)指纹信号响应强度; (3)指纹信号均化系数γ 指纹向量P = (A1 , A2 , A3 , …, An ) ,根据指纹峰等信号强度分布最理想,用P和a = (1, 1, 1, …, 1)夹角余弦值即P与a相似度系数γ表征指纹信号均化程度,γ越接近1,则信号平均化越好。综合β, γ影响,则R≈ A0 nβγ,令F = lgR = nβγlgA0 ,称F为色谱指纹图谱指数。若理想FP时间为50 min,实际为t, t越小表明时间效率越高,同时考察1 mg药材(或制剂)提取物进样后的F值,则得到色谱指纹图谱相对指数Fr :Fr =50F/Q t=50nβγlgA0/Q t。Q是与一次进样量相当的原生药材(或制剂)质量(mg) , t最后一个指纹峰出完峰时间(min) 。测定大青叶F和Fr 结果见表2。根据实验结果,γ应不低于0. 81,大青叶β值均为1, F和Fr 值应分别不低于70和5. 5 ×10 7 ,否则为不合格药材。
3. 5 含量相似度[ 5 ]  
相似度概念只说明化学成分分布的相似性,不具有定量性质。在取样量、提取方法和进样量固定前提下,文献[ 5 ]提出含量相似度( P)评价方法。不同产地大青叶含量相似度P结果见表2,其中商洛Ⅰ含量相似度最低,而宝鸡Ⅳ、渭南Ⅱ和商洛Ⅱ含量较高。
4 讨  论
为获得良好的重现性,控制好实验时温度、进样时间,经常更换电解质和清洗好毛细管柱至关重要。由于所用硼砂和硼酸缓冲盐体系中的B原子能够与中药中不同组分形成荷电性质差异较大络合物,因此不同组分获得了良好分离。BGE中使用了大比例的硼酸,目的在于提高硼酸盐的浓度,使分离效果更佳。样品经水煮后,醇沉可除去大量杂质如鞣酸类,使电泳图基线好。本实验用色指纹图谱指数F和Fr 评价了大青叶CEFP,进行了含量相似度方面的探讨,结果表明这些参数可在一定程度上评价指纹图谱的特性。合理选择BGE构成、采用灵敏度较高检测设备,可实现绝大多数中药成分基线分离。本文方法可为大青叶质量控制研究提供参考。

References
1 Editorial Committee of the Pharmacopoeic of Peopubblic of China (中华人民共和国卫生部药典委员会). The Pharmacopoeia of the People′s Republic of China, Part 1. (中华人民共和国药典(一部) ). Beijing (北京) : Chemical Industy Press(化学工业出版社) , 2000: 17
2 Sun L ixin (孙立新) , NingL ili (宁黎丽) , Bi Kaishun (毕开顺). Journal of ChineseM edicalM aterials (中药材) , 2000, 23(10) : 609~612
3 Sun Guoxiang (孙国祥) ,Wan Yuesheng (万月生) , Sun Yuqing (孙毓庆). Chinese Journal of Chrom atography (色谱) ,2004, 22 (3) : 206~209
4 Sun Guoxiang(孙国祥) ,L iu Xiaoling(刘晓玲) ,Deng Xiangyu (邓湘昱). ACTA Pharm aceutica S inaca (药学学报) , 2004,39 (11) : 921~924
5 Sun G X,Wang Y, Sun Y Q,Bi K S. Analy tical Sciences, 2003, 19 (10) : 1395~1399

作者:孙国祥,慕善学,侯志飞,刘晓玲,孙毓庆

作者: 2006-3-27
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