栀子超微饮片的HPLC指纹图谱研究

关键词:栀子超微饮片; HPLC指纹图谱;高效液相色谱法
摘要:目的:研究栀子超微饮片的指纹图谱。方法:色谱柱为大连依利特公司Hypersil BDS C18 ( 4.6 mm×200mm, 5μm)。流动相为乙腈-水(10∶90) ,柱温为25℃,流速为1.0mL/min,检测波长为238nm,进样量为10μL。结果:初步建立了栀子超微饮片的HPLC指纹图谱,标定了7个共有指纹峰。结论:利用栀子超微饮片HPLC指纹图谱可以较好地反映栀子超微饮片的内在质量。
栀子为茜草科植物Gardenia jasm inoides Ellis的干燥成熟果实,具泻火除烦,清热利尿,凉血解毒的功效。栀子的主要有效成分为栀子苷,其具有抗炎、解热、利胆和轻泻作用。本文通过对浙江、湖南、北京等14个不同地区的商品栀子药材制成的超微饮片进行测定,建立指纹图谱,并对栀子超微饮片中栀子苷的含量进行了测定。
1　仪器与试剂
1. 1　仪器
高效液相色谱仪(岛津LC-10 ATVP高效液相色谱仪,紫外检测器SPD-10 AVP,浙江大学N2000型色谱工作站) ,AE240型电子分析天平。
1. 2　试剂
乙腈和甲醇为色谱纯,水为双蒸水。
1. 3　对照品
栀子苷( Geniposide 1107492200309) ,供含量测定用,中国药品生物制品检定所提供。
1. 4　药材
14批商品栀子药材分别购自四川、杭州、广州、甘肃、北京、重庆、湖南、辽宁等地。加工成超微饮片。
2　方法与结果
2. 1　供试品溶液的制备
取栀子超微饮片,精密称定约2.0g。置于50mL的量瓶内,加入甲醇40mL,超声提取20min,冷却至室温,再加入甲醇至刻度,定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
2. 2　对照品溶液的制备
精密称取栀子苷对照品5mg置50mL量瓶中,加甲醇溶解并至刻度,摇匀,即得。
2. 3　色谱条件
色谱柱为大连依利特公司Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×200mm,5μm) ,流动相为乙腈-水( 10∶90) ,柱温为25℃,流速为1.0mL/min ,检测波长为238nm,进样量为10μL。
2. 4　方法学考察
2. 4. 1　精密度试验
取同一份栀子超微饮片的供试品溶液连续进样5次,比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积,结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致,RSD <2,符合指纹图谱的检测要求。
2. 4. 2　稳定性试验
取同一份栀子超微饮片的供试品溶液,分别在制备后0,2,4,6,8h进样,比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积,结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致,RSD < 2 ,表明样品在8h内稳定,符合指纹图谱的检测要求。
2. 4. 3　重复性试验
取同一批栀子超微饮片样品5份,分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,进行测定,比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积,结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致,RSD < 2,符合指纹图谱的检测要求。
2. 5　指纹图谱的建立
2. 5. 1　共有指纹峰的标定
采用相对保留时间标定共有指纹峰,以图谱中栀子苷为参照物,将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较,其比值为各色谱峰的相对保留时间,计算14种不同地区药材指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间,其中7个色谱峰为各样品所有,故标定它们为共有指纹峰。各共有指纹峰的相对保留时间分别为; 峰-1 ( 0.086 ) 、峰-2(0.130)、峰-3(0.192) 、峰-4( 0.348) 、峰-5( 0.623)、峰-S(1.000) 、峰-6(2.096)。
2. 5. 2　共有指纹峰的相对峰面积
以图谱中栀子苷为参照物,将各色谱峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较,其比值为各色谱峰的相对峰面积。据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定,各共有指纹峰的面积比值必须相对固定:单峰峰面积占总峰面积≥20,其差值< 20;单峰峰面积占总峰面积≥10而< 20,其差值< 25 ;单峰峰面积占总峰面积< 10 ,峰面积比值不作要求,仅需要标定相对保留时间。因栀子超微饮片指纹图谱峰数少,对单峰峰面积占总峰面积< 10的共
有峰也进行了计算(如峰24、峰25) 。
2. 5. 3　非共有峰面积
通过对14批栀子超微饮片供试品的测定,统计非共有峰面积占总峰面积的百分比,大部分< 10 ,符合指纹图谱检测要求。但有4个超过了要求。
2. 6　14批栀子超微饮片由于产地不同,其栀子苷的含量也有差别。
3　相似度计算
采用中南大学“计算机辅助相似性评价系统”进行相似度计算。
有关参数设置如下:
预处理:数据压缩　50003 15,压缩层数　2;数据平滑，使用移动窗口多项式最小二乘拟合平滑;数据平移，二标准峰平移,选择6、7两个标准峰进行平移。谱峰处理:谱峰识别　所有指纹图谱同一阈值0.02;自动谱峰匹配。
以14批样品经计算得出的共有模式峰作为比较的标准图谱。
相似度计算(全谱)结果14批药材中有13批药材的相似度在0.90以上,只有第3批(辽宁)稍低,为0.8720。
4　讨论
4. 1　超微饮片是我院研制的一种新型中药饮片,采用指纹图谱技术来控制其质量具有较强的专属性。同时也对各批栀子普通饮片进行了指纹图谱分析,结果与超微饮片基本一致。
4. 2　在用高效液相色谱法检测时,发现用乙腈-水系统( 10∶90)比文献报道的乙腈-水系统(15∶85)分离的效果更好。
4. 3　参照物的选择
栀子超微饮片中桅子苷的含量高且稳定。《中国药典》2000版一部以栀子苷作为栀子的薄层色谱鉴别,高效液相
色谱含量测定的对照品。因此选其作为参照物,在图谱中为6号峰。各样品的中的栀子苷参照峰是根据其保留时间与栀子苷的保留时间基本一致而确定的。
4. 4　测定结果表明大部分样品栀子苷含量均超过1. 8 ,符合2000版《中国药典》(一部)栀子项下要求,但湖南和江西两个样品达不到药典的要求(分别为1.45 和1.61) 。不同地区栀子生品中含量差异较大。