耐非生物胁迫转基因水稻的培育——现在和未来

环境胁迫如干旱、土壤盐渍化和极端温度等严重影响了作物的生长和发育，降低了产量。为了保障粮食安全，改善和提高作物对非生物胁迫的抗性一直是农业生产的主要目标之一。水稻是世界上近一半人口的主要粮食资源，而水稻生产不能满足消费需求，在未来50年，水稻生产将会面临更大的挑战，所以培育具有抗逆性的新品种，对全球的粮食生产将产生重要影响。然而，由于植物抗逆反应是一个极为复杂的过程，过去，利用传统的育种方法进行耐逆品种的培育进展缓慢。近年来，随着植物分子生物学的发展，发掘了一些与抗逆相关的新基因，对这些基因的表达方式及其在抗逆反应中的作用已逐步得到了解，这为耐逆转基因作物品种的培育开辟了新的途径。在改善水稻的抗逆性方面，转基因技术比传统方法更有发展潜力，因为将一个或多个基因转入其基因组中不会影响水稻的遗传背景且能够实现遗传性状的定向改变。近10年来，已有许多抗逆相关基因转入水稻，并获得了一些提高抗逆性的转基因植株，其主要进展概况见(表1)。  



1    增强对高盐和干旱的耐性  



土壤盐渍化是影响作物产量的最主要的环境胁迫因子之一。越来越多的证据表明，Na+/H+  逆向转运蛋白(Na+／H+antiporter)在植物抗盐中起重要作用。近来研究发现，携带  Na+/H+  逆向转运蛋白的转基因水稻增强了对盐胁迫的耐性，如过量表达  OsNHX1  (NHX1  from  Oryza  sativa  L.)和  AgNHX1  (NHX1  from  Atriplex  gmelini  C.A.Mey)的转基因水稻均增加了对盐胁迫的抗性，本实验室将  SOD2(a  plasma  membrane  Na+/H+  antiporter  from  Schizosaccharomyces  pombe)和  SsNHX1(NHX1  from  Suaeda  salsa  L.)分别导入水稻也得到类似的结果。实验结果显示，SOD2  转基因水稻根部的  P-ATPase  和  SsNHX1  转基因水稻地上部的  V-ATPase  的水解活性在盐胁迫下明显高于非转基因对照，说明维持  Na+/H+  逆向转运蛋白的活性需要跨膜质子电化学梯度提供驱动力。因此，预测，将Na+/H+  逆向转运蛋白和质子泵共表达可能会比其中之一单独表达赋予转基因植物更强的耐盐能力。本实验室研究表明，无论在室外含盐(300  mmol/L  NaCl)土壤中和还是在室内含盐(150mmol/L  NaCl)培养基上共表达  SsNHX1  和  AVP1  (Arabidopsis  vacuolar  H+-PPase)的转化苗的抗盐水平都比单一表达  SsNHX1  转化苗的高，为上述预测提供了初步的实验证据。  



高盐不仅破坏离子平衡而且还导致渗透胁迫。研究发现，通过积累渗透保护物质调节渗透平衡是植物在极端环境中生存的基本策略。大量研究表明，将合成此类物质的基因转入不能合成渗透保护物质的植物中，是从遗传上提高植物抗渗透胁迫能力的有效途径。Sakamoto  等发现，将  Arthr0bacter  globiformis  的  codA(choline  oxidase)分别定向转入水稻叶绿体(ChlCOD  plants)和细胞质(CytCOD  plants)得到的转基因植株在盐和低温胁迫下对光抑制的耐性不同，其中  ChlCOD  植株比  CytCOD  植株对光抑制具有更大的耐受性，说明转基因植物甜菜碱生物合成的亚细胞定位是有效增强抗逆性的关键因素。Mohanty  等也报道，携带同样基因的转基因水稻增加了对盐胁迫(150mmol/LNaCl)的抗性。  



多胺类物质如亚精胺和精胺在生理浓度下对植物耐盐起重要作用。表达燕麦  ADC(Arginine  decarboxylase)  cDNA  的转基因水稻在盐胁迫下  ADC  活性增加，积累聚氨，与对照相比，生物量也增加，Capell  等也报道了类似结果。Thu-Hang  等证明，在水稻中过量表达  samdc(Datura  stramonium  Sadenosylmethionine  decarboxylase)  cDNA  能在叶中充分积累亚精胺并在种子内积累亚精胺和精胺。他们的研究暗示，多胺合成下游途径2个组分中任何一个酶活性的增加都会引起高水平多胺的积累，从而增强转基因水稻对非生物胁迫的抗性。  



海藻糖广泛分布于植物界，在水胁迫条件下，能稳定脱水酶、蛋白和脂膜并保护生物大分子结构的完整性。过量表达大肠杆菌(Escherichia  coli)海藻糖生物合成基因(  otsA  和  otsB  )的转基因水稻在盐、干旱和低温下，海藻糖积累增加，能够持续生长，减少了光氧化伤害并较好的维持矿质营养平衡。Jang  等也研究了大肠杆菌海藻糖合成基因在转基因水稻中的作用，他们把编码双功能融合蛋白的基因  TPSP(bifunctional  fusion  of  the  TPS  and  TPP)  转入水稻发现，由于海藻糖的积累使转基因水稻提高了对干旱、盐和寒冷胁迫的抗性。  



尽管耐盐转基因水稻的培育取得了很大进步，但迄今为止，绝大多数研究结果来自实验室、温室或人为控制盐浓度的条件下，在盐渍化土壤中生长的转基因水稻既没有增加产量也没有实现商业化生产。主要的原因可能是因为植物很少经历单一胁迫，在田间条件下往往是多种胁迫相互作用，所以，目前得到的转基因水稻不能很好地在盐渍化土壤中生长。此外，耐盐转基因水稻的培育没有取得令人满意的结果还与植物对盐胁迫应答的遗传复杂性有很大关系。  



2    改善光合作用  



环境胁迫降低了光合效率，导致作物产量下降。十几年来，研究者尝试通过将  C4  作物光合循环中的关键酶导入  C3  作物来改善其光合效率并提高产量。Ku  等发现，将玉米  PEPC(phosphoenolpymvate  carboxylase  )转入水稻，降低了转基因水稻光合作用的氧抑制，提高了光合效率。他们还发现，表达玉米  PEPC  或  PPDK  (pyruvate,orthophosphate  dikinase)  的转基因水稻光合能力提高，同时高水平表达这2种酶的转基因植株也具有高的光合能力。携带  PEPC  的转基因水稻能够保持高的光合效率，PsⅡ  产生的光量子产量高且在光抑制和光氧化条件下具有消散过剩光化学和非光化学能量的能力。此外，表达  PEPC  和  PPDK  的转基因水稻产量也高于非转基因对照。这些结果表明，将  C4  植物的光合酶转入水稻，对增强其抗逆性、提高光合能力和产量具有较大潜力。  



3    提高对极端温度的耐性  



极端温度抑制了水稻的生长和发育。研究表明，将耐受低温/高温的相关基因导入水稻能提高转基因水稻对极端温度的耐性。Ariizumi  等发现，在水稻中过量表达  GPAT(glycerol-3-phosphate  acyltransferase)  增加了叶内磷脂酰甘油中的不饱和脂肪酸的量，提高了转基因植株在低温下的光合效率，增强了生长能力。表达拟南芥  hsp101  (Athsp101)  cDNA  的转基因水稻在不同水平的高温胁迫后，恢复生长情况明显好于对照。  



4    调节胁迫相关基因的表达  



许多研究表明，控制信号传导的调节因子是改善植物耐逆水平的富有前途的方法。水稻  OsCDPK7(Ca2+-dependent  protein  kinase)是与耐寒冷和盐/干旱有关的正调节因子(主要在维管组织表达)。sajjo  等发现，过量表达  OsCDPK7  的转基因水稻增强了胁迫信号在遗传作用区(维管组织)的传导，改善了耐逆性。他们还报道，在水稻中过量表达  OsCDPK7，促进了对干旱/盐而不是寒冷应答的某些胁迫应答基因的诱导，暗示引起寒冷和盐/干旱耐性的下游途径不同。这些结果显示，在改善植物的抗逆方面，单一控制  CDPK  的活性就有很大潜力。然而，过量表达  OsCDPK2(CDPK  isoform)发现，在有光条件下，转基因水稻的绿色叶内没有  OsCDPK2  的过量表达，且其种子的形成和发育在早期就受到严重抑制，只有3％～7％的花产生种子，这说明不同的  CDPK  同工型在不同条件下具有复杂的调控机制。CBF3  和  ABF3  分别是拟南芥中不依赖于  ABA  和依赖于  ABA  胁迫应答途径的调节基因。Oh等发现，表达  CBF3  的转基因水稻提高了对干旱和高盐的耐性，但对低温的耐受水平较低，此结果与  CBF3  在拟南芥中的作用相反—主要增强耐寒性；而  ABF3  转基因水稻只增加了对干旱胁迫的耐性。由此推测，不耐寒冷的水稻与适应寒冷的拟南芥可能具有不同的进化途经。  



5    改良营养状况  



全世界有近30％的耕地由于土壤  pH  过高降低了  Fe  的有效性，影响了作物的生长和发育，造成减产。水稻是对  Fe  缺乏特别敏感的作物之一。表达大麦  naat  (nicotianamine  aminotransferase)  的转基因水稻在缺  Fe  条件下表现出高的该酶活性并能分泌大量的植物含  Fe  细胞，增强了对低  Fe  的耐性且在碱性土壤中其粮食产量比未转基因对照多  4.1倍。Goto  等将编码大豆  ferritin  的全长序列导入水稻发现，该基因的表达使转化体  T1  代种子内  Fe  的含量比非转化体的增加了3倍。Drakakaki  等也研究了含  ferritin  的转基因小麦和水稻，他们发现这2种植物的营养组织中  ferritin  的  mRNA  水平相似，但其蛋白水平在水稻中较高。利用  ICAP  (inductively  coupled  argon  plasma)光谱测定法进一步分析显示，Fe  水平只在转基因植物的营养组织内提高，种子中并没有改变，说明该基因的表达具有器官特异性且受转录后调控。  



6    减少氧化胁迫  



已知  Bacillus  subtilis  Protox  (Protoporphyrinogen  oxidase)  是一种抗除草剂的酶。Lee  等将B.subtilis  Protox  分别定位在水稻的细胞质和质体内发现，转基因水稻增加了对除草剂  (oxyfluorfen)的抗性，减少了细胞质渗漏和叶绿体损伤，降低了脂质过氧化。他们还发现，转基因水稻对除草剂的抗性水平与  Protox  的亚细胞定位密切相关，其中  Protox  定位在质体内的比其定位在细胞质内的转化体呈现出更高的水平。Shimizu  等研究表明，表达  Ralstonia  eutropha  NH9  cbnA  (chlorocatechol  dioxygenase)  的转基因水稻，能有效的将有毒化合物(3-chlorocatechol)转化为无毒化合物(2-chloromucote)，而转化体的生长和形态与对照元明显差异。他们的结果说明，利用含此类基因的转基因水稻分解土壤和水体表面的氯化芳香化合物  (chloroaromatic  compounds)  是可能的。  



抗氧化剂基因对促进人们了解胁迫条件下特定抗氧化剂的防御作用有重要意义。本实验室从盐地碱蓬  (Suaeda  salsa  L.)  cDNA  文库中获得谷胱甘肽转移酶基因  (Glutathione  S-transferase，EC  2.5.1.18，GST)  和过氧化氢酶基因  (Catalase，EC  1.11.1.6，CAT1)，在水稻中表达  GST  和  GST+CAT1  减轻了盐、除草剂驯和低温胁迫下的氧化损伤。在应用的氧化胁迫下，转基因水稻特别是  GST+CAT1  共转化体细胞膜透性、H2O2  的产生和  MDA  (malon  dialdehyde)  的积累均低于非转基因对照。这些结果说明，GST  和  CAT  在植物防御和抗氧化胁迫中起重要作用。  



总之，不同基因对转基因水稻耐逆性的贡献不同。虽然由于外源基因的作用机制、整合位点及转录后调控等原因很难比较不同基因转化体的耐逆效果，但从本实验室的研究结果来看，SsNHX1  和  AVP1  共表达比  SsNHX1  单一表达赋予转基因水稻更高的耐盐水平；表达单一抗氧化酶(如  GST  )的转化苗不如表达单一  Na+/H+  逆向转运蛋白(如  SsNHX1)的转化苗耐盐效果好；共表达双抗氧化酶(如GST+CAT1)的转基因水稻比表达单一抗氧化酶(如  GST)的转化体抗逆性强。  



7    现在和未来  



尽管耐逆转基因水稻的培育取得了显著进步，但目前的成绩并不令人满意。主要原因包括(1)大多数转基因水稻的耐逆水平有限，不足以在环境胁迫条件实现正常生长，更不用说增加产量和商品化生产；(2)植物耐逆是一个复杂的性状，受基因网络中各个基因的协调和差异表达的影响，而目前人们对此机制还缺乏全面了解，只有获得功能基因组内关于耐逆主效基因和重要目标基因的更多信息，才能有效控制抗逆基因的表达；(3)外源基因在水稻基因组中的整合率低，仅在活泼转录区(即基因丰富区)发生整合，导致转化率低，获得的转化体少；(4)由于基因沉默等原因使转入的基因不能正常表达，或不能在后代中稳定遗传，或导致植物不育；(5)转基因水稻中使用的标记基因可能会影响环境和食品的安全性，因而限制了其在农业生产中的推广和应用。尽管如此，随着对植物功能基因组的研究，人们会获得关于植物感受和传递胁迫信号，启动适应反应机制的更多信息，因此，把新的目标表达调控系统与有用基因结合起来，将为耐逆转基因水稻和其它作物的培育提供更为有效合理的新策略。此外，随着转基因技术的不断改进，必将产生无标记基因的抗逆转基因水稻。  



简而言之，抗逆转基因研究的主要目的是增加水稻和其他作物的产量。水稻耐逆是一个复杂的性状，牵涉许多生理和生化机制及无数基因，因此，要从遗传上改善水稻的耐逆水平，就必须将不同的策略进行实验尝试。最终将这些不同策略和具有特定功能的基因融合起来以大幅度增强水稻的耐逆能力。更重要的是若把转基因技术和传统育种方法结合起来，将是培育耐逆水稻品种的有效途径。