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来自中国农业大学，东北农业大学等处的研究人员利用shRNA与高效的“睡美人”(sleeping beauty, SB)转座子系统，生成了能抑制口蹄疫病毒3D 基因复制的山羊，这为研究山羊抑制口蹄疫病毒复制提供了理论依据。
口蹄疫(food and mouth disease, FMD)是哺乳动物的一种高度接触性传染病, 由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)引起。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属病毒, 为单股正链 RNA 病毒, 有 7种血清型, 分别为 O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 和Asia, 每种类型中又有多个亚型, 遗传变异频率高, 各型之间几乎没有免疫保护力。FMDV基因组中高度保守区域有 3D(RNA 聚合酶), 2B(非结构蛋白, 宿主范围决定因子)等基因, 针对FMDV 基因组保守序列, 通过RNAi可以解决血清型间不能交叉保护的问题。
转基因技术已广泛应用于提高家畜生产性能和抗病育种等方面, 生产转基因动物的方法有很多种, 但转基因技术的效率仍然很低。转座子(transposon)又称跳跃基因, 是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的 DNA 序列, “睡美人”转座系统(sleeping beauty, SB)是 Tc1/mariner 转座因子超家族中的一员, 是第一个应用于高等哺乳动物细胞相关研究的转座子, 在脊椎动物中比其他转座子活性高。 SB转座子包括编码转座酶的基因和末端反向重复序列(IR/DR), 转座酶是转座的催化因子, 促进转座的发生, 转座机制是经典的“切割与黏贴”。SB 转座子可以通过生殖细胞稳定地遗传给后代, 其在基因转移和基因标签等方面都已经发挥了重要作用。
在这篇文章中，研究人员通过筛选FMDV 基因组中高度保守区域的 shRNA, 构建含shRNA的SB转座子表达载体, 采用原核注射法生产抑制 FMDV 基因组中高度保守区域的转基因山羊。
研究人员对口蹄疫病毒基因(2B, 3D) shRNA 抑制靶点进行筛选, 构建了 3条含靶基因 shRNA的 pLL3.7表达载体, 与含靶基因psiCheck2载体(双荧光素标记)共转染293FT细胞, 对合成的shRNA进行筛选. 获得的抑制效果好的3D1shRNA (干扰 3D基因)插入到 SB转座子载体上, 将含 3D1shRNA的 SB转座子与转座酶(2:1, 5:1, 10:1)通过原核显微注射生产转基因山羊。
出生羔羊进行 Southern blot 与整合位点鉴定, 对阳性个体耳成纤维细胞转染含3D基因的pisCheck2载体, 观察其抑制率. 结果共获得了 7 只阳性山羊。SB 转座子与转座酶的比例为 10:1 时, 生产转基因山羊的效率为21.05%. 阳性个体耳成纤维细胞对口蹄疫病毒 3D基因有显著抑制效果。 而且这项研究通过原核显微注射法, 利用SB 转座子系统生产转基因山羊, SB 转座子与转座酶的比例为 10:1 时, 转座的效率最高。
总而言之，这一研究成果针对FMDV基因组中高度保守区域3D基因设计shRNA, 结合高效的 SB 转座系统与 RNAi 技术, 采用原核注射法制作转基因山羊, 生产出抑制FMDV-3D基因复制的山羊, 为研究山羊抑制FMDV复制提供了理论依据。