电穿孔和电融合技术

　　【实验目的】

　　1．了解细胞电穿孔和电融合的基本原理

　　2．学习电穿孔和电融合基本技术

　　【实验原理】

　　当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用的导入外源物质的方法相比，电穿孔具有很多优点。首先，不必象显微注射那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。

　　除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分子扩散入胞液中以外，高强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。然而，在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触，这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。几个实验室已证明使用电场电融合效率比常规的化学融合方法高10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。

　　【仪器、材料和试剂】

　　仪器：脉冲发生器；样品池（一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极）；CO₂培养箱，显微镜；离心机，微量移液器，镊子，剪刀，手术刀片，三角瓶，吸管，毛细管，离心管，载玻片，盖玻片，NALGEN一次性滤器。

　　材料：外源DNA，对数生长中期细胞

　　试剂：

　　穿孔介质（PM）：磷酸钾 15mmol/L

　　MgCl2 　1mmol/L

　　蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　

　　HEPES 10mmol/L　调节pH至7.3

　　融合介质（FM）：MgCl2 1mmol/L

　　甘露醇 280mmol/L

　　HEPES 　2mmol/L　调节pH至7.3

　　【方法与步骤】

　　悬浮细胞的电穿孔法：

　　1．电穿孔进行基因转移

　　电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中，操作步骤相似。本实验中，我们以基因转移为例。载入其他的分子时，只需把外源DNA换成所需分子即可。

　　1.1　使细胞在适宜的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。

　　1.2　在穿孔介质（PM）中至少洗一次。洗细胞时，在台式离心机上1000rpm离心3分钟，使得悬浮细胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介质中重新悬浮细胞。

　　1.3　计数细胞，在PM中，浓缩细胞为大约1千万细胞/ml。

　　1.4　将DNA加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管吸一定体积的细胞-DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。

　　1.5　在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度（脉冲宽度是指数衰减函数的时间常数，即τ=RC，C是电容，R是样品的电阻）。假如设备是CD脉冲型发生器，设定电容和并联电阻，以达到合适的τ值。

　　1.6　将小池放进盛样品的池中，启动电穿孔装置，供给所需的电脉冲。

　　1.7　电处理后，向小池加1ml普通培养基，将细胞混合液从小池转移到组织培养容器（培养皿或培养孔）中，再加入一些培养基使最终的培养基体积适量。然后，将样品细胞放回孵育箱中使之在正常条件下生长。

　　1.8　在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时间不同。

　　2．检测电穿孔效率和细胞存活率

　　2.1 除用罗丹明偶联葡聚糖（1mg/ml）（分子探针）代替DNA外，将罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞的方法如前所述。

　　2.2 电穿孔后，用培养基洗涤细胞两次，去掉胞外的荧光葡聚糖。

　　2.3 电穿孔后30min，向细胞悬液中加30μl台盼蓝，孵育2min，然后用培养基洗涤。

　　2.4 在1000rpm下离心3min，收集细胞，将细胞重悬于PM中，终体积100μl。

　　2.5 将一滴细胞液（30μl）置于干净载玻片上，用盖玻片盖好，在显微镜下检测细胞，测定摄取荧光标记葡聚糖的百分数。

　　2.6 在亮视野镜片下，死细胞可因染成蓝色检测出（摄取了台盼蓝），测定细胞存活的百分数。

　　2.7 在各种电场设定值下重复实验，画出摄取葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。这一曲线就将显示对特定细胞类型电穿孔的最优条件。

　　悬浮生长细胞的电融合

　　融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似，只是在进行高强度的电场脉冲前后，必须用低幅、高频电场使细胞排成一条链。

　　1．用融合介质（FM）洗悬浮细胞两次，然后悬于FM中。洗涤细胞时，在台式离心机上1000rpm下离心3分钟，得到细胞沉淀，弃去上清液将细胞悬于新鲜FM介质中。

　　2．将悬浮细胞转移到相应的融合室内。假如要使两种不同的细胞彼此融合，转移前要充分混合。

　　3．启动介电电泳场，其振幅通常小于200V/cm，频率在2MHz以内，用显微镜检测细胞是否排成一条链，调节振幅和频率以达到最佳效果。

　　4．让介电电泳场开约1分钟后关掉，立即应用融合脉冲，其振幅数量级为1kV/cm。脉冲宽度小于1ms。在进行融合脉冲后立即再次启动介电电泳场，常规让其开启约2分钟。

　　5．关掉介电电泳场，让细胞在样品池中静置10分钟。

　　6．去掉FM，用普通培养基再次洗涤细胞。

　　7．将细胞转移到培养皿，加入普通培养基，在培养箱培养。

　　【注 意 事 项】

　　1．最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意，就应尝试改变穿孔介质。

　　2．影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关，为达到最高效率，必须收集对数生长中期的细胞。

　　参考文献

　　1．黄培堂等译　细胞实验指南　北京：科学出版社,2001,793-800

　　2．汪和睦等　　细胞电穿孔电融合电刺激原理技术及应用　天津科学技术出版社,2000,183-235