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RNA几乎总是单链的。但几乎每个RNA分子都有许多短的双螺旋部分，称为发夹。这是因为在发夹中，一条RNA链上的两个节段是反平行走向的，可形成碱基对而产生双螺旋区。此外，除了标准的GC和AU对之外，还有较弱的GU对可帮助形成单链RNA的二级结构，一条正在延伸的RNA链的二级结构影响这个RNA分子的剩下部分的转录状况一个细胞中含有许多不同的RNA子，其长度可从小至到50个核苷酸到大至数万个核苷酸不等。这些几乎总是线性单链RNA分分子，极少有环状RNA分子。
在细胞周期的某一阶段，DNA双链解开成为转录的模板。一切细胞均具有RNA聚合酶。E.coli细胞中约有RNA聚合酶分子3000个以上。此酶催化RNA主链中核苷酸间的3'，5'磷酸二酯键的形成。催化反应速度很快，在37℃时RNA链的延伸可达40个核苷酸/秒。但是这种催化作用必须有DNA(作为模板)的存在。RNA的合成一定要非常精确。然而不像DNA那样，转录作用并没有校正（proofreading）机制。但由于细胞RNA不能自我复制，故即使偶有差错亦不会遗传下去。双螺旋DNA分子中仅有一条链可作为RNA的模板。如果说，DNA分子中的两条链均可作为RNA的模板，则每个基因势必将产生两条有互补顺序的RNA。然而遗传学证明每个基因只控制一个蛋白质，故实际上只合成了一条RNA链，或者即使合成两条RNA链，其中也只有一条有功能。事实上，在活体内，只存在着这两条可能RNA链中的一条。在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中繁殖的病毒SP8的DNA中，两条互补链的碱基组成截然不同，或者比较容易地分离开来，因而有可能确定活体内的RNA的碱基顺序是否和两条(还是仅和一条)DNA互补。将双链DNA加热到接近100℃以使之变性，再加入用此DNA为模板所合成的单链RNA，再进行退火。结果除复性的DNA双螺旋外，还形成了DNA-RNA杂种分子。实验的结果是很明确的，即仅有一条DNA链被转录。
如果用RNA聚合酶在体外对DNA双螺旋进行转录，则结果取决于DNA模板受到损伤的程度。例如将T7DNA变性，使RNA聚合酶能与单链DNA结合，则两条均能被转录。但如果用天然的完整双链DNA为模板，则RNA聚合酶仅能和称为启动子的顺序结合，从而只能转录在活体内被转录的那条链。